顺铂耐药性机制分析
（一）促进DNA损伤的修复
顺铂促使DNA复合物的形成对于促进肿瘤细胞凋亡发挥了至关重要的作用，提高DNA复合物的修复率会抑制肿瘤细胞发生凋亡。有研究通过不同种属的肿瘤细胞实验发现，抑制药物产生的细胞毒性后，提高DNA复合物的修复率可以抑制肿瘤细胞发生凋亡。在发生耐药性的肿瘤细胞中，DNA复合物的自我修复率往往较低。然而，当这种自我修复机制存在时，尽管其修复率低下，肿瘤细胞对顺铂产生耐药性的发生率也比没有该功能时高1.5～2.0倍。长时间使用顺铂时，DNA复合物的自我修复率增高的幅度不大，从而导致这种修复机制产生的调节作用有限。
DNA修复途径中的核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）、错配修复、碱基切除修复等均与肿瘤细胞对铂类药物产生耐药性有关，而NER通路被认为是机体内修复DNA损伤的最主要途径。NER通过识别损伤位点，将包含全基因组的核苷酸切除来进行修复。NER主要修复那些影响区域性染色体结构的DNA损害，包括DNA复合物和DNA交互连接。NER的主要作用在于发现细胞信号通路中存在的缺陷，并且恢复NER的完整性，从而增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性。NER具有特异性，由于顺铂诱导产生的复合物与其他铂类药物诱导产生的复合物在功能与结构上没有差别，DNA复合物修复机制在其他铂类药物应用时同样存在，所以这种修复机制的存在是铂类药物产生耐药性的主要原因之一。NER涉及的复合物包含17种不同的蛋白质，但在化疗药物耐药性的细胞研究中发现，仅有少数蛋白质参与切除修复机制。切除修复交叉互补组1（excision repair cross-complementation group 1，ERCC1）基因是NER的主要成员，研究发现，ERCC1的表达水平与肿瘤细胞对顺铂的敏感性存在负相关，ERCC1基因多态性是ERCC1表达水平的主要影响因素，不同基因型的ERCC1在肿瘤细胞中表达效率及高低不同，ERCC1基因多态性与铂类药物疗效间存在相关性。ERCC1基因多态性可改变ERCC1的DNA修复能力，其118密码子C＞T的突变定义为无义突变，即密码子AAC和AAT均编码天冬酰胺（asparagine，Asn）。但有研究发现，该无义突变能影响ERCC1蛋白的表达水平。T等位基因携带者的ERCC1 mRNA水平更高，DNA修复能力更强，可引起患者对铂类药物的敏感性下降，药物疗效降低。
顺铂是临床上广泛应用的一种抗癌药物，它含有一个铂原子、两个氯原子和两个氨分子，是一种无机络合物，结构很简单。顺铂通过与肿瘤细胞中的DNA结合，形成链内、链间连接，影响DNA的功能，干扰DNA复制、转录，并激活P53信号通路，诱导肿瘤细胞发生凋亡。目前有研究发现，P53通过调控Bcl-2基因的表达来诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗目的。Bcl-2蛋白家族成员均含有数量不等的同源结构域，即BH（bcl-2 homology）结构域，该结构域在结构上与α螺旋有关。Bcl-2家族大体分为三大类：①促凋亡蛋白，Bax、Bak；②抗凋亡蛋白，Bcl-2、Bcl-w；③BH3-only蛋白。Bcl-2蛋白含有3～4个BH1～BH4结构域，该结构域不具备酶的催化活性，但可发挥调控靶向蛋白的作用。BH3-only蛋白仅有BH3结构域，因此被称为BH3-only蛋白。该蛋白在凋亡反应中不能独立发挥作用，其需要Bax和Bak等成员共同协作，因此在凋亡反应过程中仅仅发挥信号转导作用。BH3-only蛋白将不同种类的刺激信号传递给Bcl-2蛋白家族的其他成员，进而调控细胞生物学功能。另外，BH3-only蛋白通过翻译后修饰及调控蛋白转录等不同机制来调控细胞生物学功能。Bax和Bak两种蛋白质是促凋亡家族中的主要成员，其在细胞凋亡通路中发挥着重要的作用。另外，有研究发现，Bak和Bax是影响线粒体外膜通透性改变的关键蛋白质，均可促进细胞发生凋亡。Bax的结构域与Bcl-2的结构域具有一定的相似性，均含有1个BH1～BH3结构域并形成疏水沟样结构。如果其他蛋白质中的BH3结构域与疏水沟样结构发生反应，可结合形成一个寡聚体。Bax蛋白还具有介导调节蛋白的膜定位结构域和C端疏水结构域的作用。在某些特殊情况下，Bax蛋白C末端被释放并转移到线粒体外，可导致细胞发生凋亡。
（二）过表达HER-2/neu和PI3K/AKT的途径
人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2/neu）又称lien、c-erbB-2或P185。20世纪80年代，Her-2/neu原癌基因由三个研究小组分别独立发现，分子量为185000，其为具酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，编码基因定位于人染色体17q21，是表皮生长因子受体家族的成员。Her-2/neu原癌基因编码一种跨膜受体酪氨酸激酶，该酶由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三个部分组成，具有广泛的同源性表皮生长因子受体。HER-2/neu在细胞增殖、分化及血管生成等过程中发挥重要作用，其高表达可加速细胞分裂，使其增殖、分化过程失衡，最终转变为肿瘤细胞。此外，有研究发现HER-2/neu高表达可提高肿瘤细胞的迁移率、体外侵袭率和Ⅳ型胶原酶活性，且可干扰黏附分子合成，从而促进肿瘤侵袭、转移和复发。目前研究在20％～30％的乳腺癌和卵巢癌患者中发现HER-2/neu基因，该基因扩增和过度表达会导致化疗药物治疗后效果不佳。此外，有报道发现HER-2/neu基因在很多其他类型的上皮起源肿瘤中过度表达，如肺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌和膀胱癌。如果用带有HER-2/neu基因的质粒转染肿瘤细胞，肿瘤细胞会产生耐药性；相反，使用活性酪氨酸激酶抑制剂减弱p185或使用HER-2/neu受体拮抗剂，均可抑制顺铂的细胞毒作用，其原因在于减弱了顺铂-DNA复合物的修复作用。有研究发现，激活p185酪氨酸激酶后，HER-2/neu受体被激活，并可激活SHC/GRB2/SOS信号通路及PI3K/AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路失调见于多种疾病，包括消化道肿瘤、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病。在消化道肿瘤中，研究者已发现两处可增强PI3K内在激酶活性的突变。另外，该信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。近年来研究发现，PI3K和其下游分子蛋白激酶AKT所组成的信号通路可调节肿瘤细胞的增殖和存活，其活性异常不仅能导致细胞恶性转化，而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关，目前以PI3K/AKT信号通路的关键分子为靶点的肿瘤治疗策略正在研究中。顺铂通过促使p21WAF1/CIP1的产生来调控PI3K/AKT信号通路。p21WAF1/CIP1是第一个被发现的CDI家族成员，又名CDK相互作用蛋白1（CDK-interacting protein 1，CIP1）、野生型p53激活性片段1（wildtype p53 activated fragment 1，WAF1）、CDK相关蛋白20（CDK-associated protein 20，CAP20）和黑色素瘤分化相关基因6（melanoma differentiation associated gene 6，mda 6）。该基因编码的蛋白质是一种细胞周期依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的抑制蛋白，它通过p53依赖和p53非依赖两种途径参与细胞生长、发育、分化、衰老及DNA损伤修复等多种功能的调节。p21WAF1/CIP1为具有广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，能与cyclin-CDK结合，使cyclin-CDK复合物的激酶活性丧失，细胞周期停滞在G1期。
研究发现，HER-2/neu过度表达可增强AKT的活性，这与p21WAF1/CIP1第145位的苏氨酸发生磷酸化有关，进而导致细胞核中的p21WAF1/CIP1表达水平下调，增强了顺铂的促凋亡作用。同样，p21WAF1/CIP1可以根据上游信号的强弱，来增高或降低PI3K/AKT的活性。此外，AKT促进MDM2蛋白磷酸化并进入细胞核，而MDM2减弱p53蛋白的活性，导致肿瘤细胞对顺铂产生耐药性。
p38蛋白激酶是最早由Brewster等在研究高渗环境对真菌的影响时发现的一种激酶。随后研究发现其也存在于哺乳动物的细胞内，是MAPKs的亚类之一，其性质与JNK相似，是一种应激激活的蛋白激酶。已发现p38蛋白激酶有5个异构体，分别为p38α（p38）、p38β1、p38β2、p38γ、p38δ。其分布具有组织特异性，p38α、p38β1、p38β2在各种组织细胞中广泛存在，p38γ仅在骨骼肌细胞中存在，而p388主要存在于腺体组织中。研究表明，p38蛋白激酶的激活影响细胞生长、周期和凋亡等，并参与炎症、应激反应的调控。另外，许多MKK激酶可以激活p38蛋白激酶信号通路，这些激酶包括 MTK1、MLK2/MST、DLK/MUK/ZPK、ASK1/MAPKK5、MAP3K和TAK1。其中MAP3K是MAPK级联反应的主要成分，其过表达可以激活p38与JNK信号通路。基于激酶催化结构域的序列，MAP3K被分为三组：MEKK样、ZIK样和Raf样家族。Raf样MAP3K构成最大的MAP3K亚家族。MAP3K通过丝氨酸和（或）苏氨酸的磷酸化激活MAP2K，并且MAP2K通过Thr-X-Tyr基序的双磷酸化激活MAPK。近年来研究发现，MAPKAP-K3（M3）是p38的底物，其属于丝氨酸蛋白激酶，激活后的M3可磷酸化其他不同的底物，包括热休克蛋白27（HSP27）、淋巴细胞特异性蛋白1、ATF1和酪氨酸羟化酶等。p38的其他底物包括蛋白激酶MNK1、PRAK、丝裂酶原和应激激活激酶MSK。JNK与p38均可磷酸化转录因子，包括转录因子1-2（ATF1-2）、Elk-1等，另外，p38还可作用于转录因子CHOP10、GADD153、C/EBP和p53等。而这些底物中ATF1和ATF2均可结合环磷酸腺苷，形成同源二聚体。它们亦可与c-Jun结合形成异源二聚体，进而调控信号通路分子的表达。有研究发现，caspase抑制剂与Fas发生相互作用，进而抑制p38的活性，从而起到调控细胞凋亡的作用。研究发现，MKK6b过表达激活caspase，导致肿瘤细胞发生凋亡。综上所述，p38信号通路通过调控caspase上游与下游信号蛋白来调控细胞凋亡。但是，p38信号通路在细胞凋亡过程中如何调控caspase，具体机制仍有待进一步研究。(https://www.daowen.com)
（三）错配修复途径
DNA错配修复基因（DNA mismatch repair gene）首先在细菌和酵母中发现，在人类基因组中也存在类似物。DNA错配修复基因既非原癌基因，也非抑癌基因，是另一类肿瘤相关基因。错配修复基因（MMR基因）是一类与人类的错配修复反应有关的基因，包括hMSH2、hMLH1、hMSH3、hMSH6、hPMSH1和hPMSH2等基因。MMR基因最早是在遗传性非息肉性大肠癌中分离得到的一组遗传易感基因，该系统任一基因发生突变都会导致细胞错配修复功能缺陷，进而导致遗传不稳定，表现为复制错误或微卫星不稳定性，因而容易发生肿瘤。1993年，Aaltonen等学者研究发现，在12％～15％的CRC患者中存在微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），他们提出了错配修复途径。该途径的基本原理是MMR基因保证了DNA复制的高度保真，如果MMR基因发生突变或启动子甲基化，引起MMR基因失活，将会导致机体错配修复功能降低，整个基因组不稳定。MMR基因功能缺陷表现型是高度的微卫星不稳定性（MSI），又称为复制错误（replication error，RER），从而使某些原癌基因和抑癌基因发生突变，并在体内快速聚集，导致肿瘤发生，在此途径中，hMLH1和hMSH2这两个MMR基因起主要作用。hMLH1的cDNA全长为2484 hp，具有编码长度为2268bp的开放阅读框。hMLH1蛋白由756个氨基酸残基组成。hMLH1蛋白的表达变化可以很好地预示MMR基因功能缺陷的存在，在结直肠癌细胞中发挥重要的调控作用。
在DNA错配修复中，hMSH2与hMSH6形成一种称为hMutSα的二聚体复合物，并结合到DNA碱基错配区，而hMLH1与hPSH2发生相互作用并形成二聚体hMutLα，该二聚体发挥识别新生DNA链的作用。hMutLα结合到DNA错配区后，可激活与MutH蛋白有关的GATC核酸内切酶，并切除未修饰的甲基化GATC序列。依赖于MutS、MutL及DNA解旋酶的协同作用，随着新生链错配区的切除，整个修复反应立即被启动。
UC相关性结直肠癌MMR基因的突变导致MMR基因功能缺陷，引起细胞基因发生突变和DNA复制错误，导致某些抑癌基因突变率增高，如积累到一定程度可导致肿瘤的发生。有研究发现，hMSH2蛋白阳性表达率从正常组织到结直肠癌组织逐渐降低，MMR基因的突变发生率随恶性程度的增加而增高，提示MMR基因的突变，尤其是hMSH2的突变可能是结直肠癌发生的早期事件之一。遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）是一种特殊类型的结直肠癌，是由于MMR基因发生突变所致的一种单基因显性遗传性疾病，又称林奇综合征，占结直肠癌的15％～18％。结直肠腺瘤在HNPCC中较易发生，而HNPCC相关腺瘤与其他腺瘤有明显不同，可以是单发，也可以是多发，组织学上多为绒毛状腺瘤，常表现为明显的异型性，可迅速由腺瘤发展为腺癌，大部分HNPCC相关腺瘤存在基因不稳定性。Russell等发现错配修复缺陷造成的微卫星DNA重复序列数不稳定与HNPCC由腺瘤向腺癌转变有关。腺瘤阶段，微卫星DNA重复序列数发生改变的比例明显低于腺癌阶段。这说明大多数HNPCC在良性的腺瘤阶段已有部分基因向不稳定发展，微卫星DNA重复序列数改变速率越快，腺瘤恶变的可能性就越大。
核苷酸错配有以下三种情况：①DNA的物理损伤；②DNA复制过程中核苷酸的错误掺入；③基因重组。DNA聚合酶能催化不能与模板形成氢键的错误碱基，这种复制错误通常由聚合酶立即纠正，再开始下一个核苷酸的聚合反应。在某些特殊条件下，DNA聚合酶将极少的错误碱基遗留在DNA链上而未予以纠正，因此，DNA错配修复必须要有错配修复系统（MMRS）参与，其在修复过程中具有高度特异性，并较为准确地识别错配碱基。错配修复反应既可修复DNA复制过程中出现的碱基错配，又可消除由于含简单重复序列的同源序列间遗传重组出现的不配对序列，这样可有效地防止DNA复制差错的产生。错配修复缺陷细胞容易对顺铂产生耐药性，但对奥沙利铂不产生耐药性，表明错配修复缺陷细胞能够耐受顺铂-DNA复合物及错配修复涉及的旁路复制。通过体外研究发现，噬菌体T7和T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、大肠杆菌聚合酶Ⅰ及大肠杆菌聚合酶Ⅲ能够以不同的方式调控顺铂旁路复制途径的活性。研究发现，人聚合酶β、γ、η（XP-Ⅴ基因的产物），Rev3/Rev7络合物和人类免疫缺陷病毒Ⅰ型逆转录酶亦可以调控顺铂旁路复制途径的活性。
目前临床上将hMSH2、hMLH1两种基因的检测作为MMR基因突变分析的初筛指标。由于结直肠癌的发生与MMR基因关系密切，且MMR基因异常者患结直肠癌的风险明显增高。因此，对有结直肠癌家族史的人群应进行MMR基因检测，以确定其患结直肠癌的风险，从而采取相应的措施，以实现早发现、早治疗。虽然目前对hMSH2等MMR基因缺陷与结直肠癌的相关性进行了深入的研究，但仍有很多问题需要解决，如MMR基因与原癌基因和抑癌基因之间的相互关系；MMR基因缺陷影响细胞凋亡的信号转导机制等。错配修复的缺陷和复制旁路的强化是肿瘤细胞对顺铂耐药的主要机制；与顺铂不同的是，MMRS缺陷和复制旁路强化不会影响奥沙利铂的细胞毒性。