肌萎缩侧索硬化症的动物模型
（一）转基因动物模型
1.SOD1转基因鼠模型
虽然肌萎缩性脊髓侧索硬化病（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）的发病机制还不清楚，但是与铜/锌超氧化物歧化酶（SOD1）基因的突变有关，在ALS家族中发现有SOD1基因突变存在，并在遗传型的ALS占有率超过20%。所以在建立动物模型时，国际上最常采用建立SOD1基因突变鼠模型来研究ALS这一疾病，其中hSOD1-G93A（第93位甘氨酸突变成丙氨酸）转基因小鼠模型是国际公认的研究ALS发病机制和临床前相关药物研究的动物模型。也有将此基因移入大鼠中的造模方式，作为研究ALS的一种理想动物模型。
SOD1基因突变作为ALS主要致病因素，SOD1作为一种酶类，以Cu2+-Zn2+-SOD形式广泛存在于神经元内，具有消除自由基、抵抗氧化损伤的作用。因此早期对ALS发病机制的认知则是：SOD1基因突变的ALS患者因SOD1酶表达活性下降，运动神经元受到氧化损伤所致。但经过不断的实验研究发现，缺乏SOD1的小鼠并不发生运动神经元损伤，而过度表达人突变SOD1（hSOD1）的小鼠产生了与ALS相似的症状，所以是因为hSOD1作为一种新的异常毒性蛋白，加速运动神经元的氧化应激，造成损伤。常用的ALS模型是表达hSOD1第93个丙氨酸被甘氨酸代替（G93A）的突变体基因移入小鼠培养的动物模型。
2.hSOD1-G93A转基因小鼠模型
将C57BL和SJL两种品系小鼠进行杂交所得到的受精卵，用细胞注射法注入将含有G93A的人SOD1基因，接种入假孕小鼠体内，产下第二代鼠（首建鼠），用PCR法检测出hSOD1基因阳性的首建鼠，并将其与C57BL6鼠回交，使突变基因稳定向下遗传。hSOD1基因阳性鼠的表现为，在15周左右出现行动不利伴有肢体震颤，相继出现后肢的萎缩消瘦，失去肢体使用能力，双侧后肢伸直，慢慢发展直到后半身的萎缩，最终于19～20周后因进食困难而死亡。该模型ALS患者的发病表现相似，适合研究ALS相关发病机制，尤其是遗传型ALS患者，适合探讨hSOD1突变蛋白毒性作用机制。但此动物模型也有相应弊端，在散发性ALS患者中存在SOD1基因突变的比例很低，还无法通过此模型很好地解释全部ALS患者发病机制。
3.AR2小鼠模型
还有研究表明，α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（α-Amino-3-Hydroxy-5-Methl-4-Isoxazolepropionic Acid，AMPA）受体介导的毒性作用在散发性ALS患者中和家族性ALS的动物模型中均具有至关重要作用。而潘卫东等利用上述研究，用Cre/loxP基因重组系统制作一种基因敲除的ADAR2小鼠，根据AMPA在ALS发病中的毒性作用，建立AR2小鼠模型。此模型适合研究ALS这一疾病，并可模拟散发性ALS的分子异常特性。
AR2小鼠模型建立：获得目标区域DNA并编辑后，注入受精卵，经C57BL雌鼠培育后获得嵌合体小鼠，其中的纯合小鼠通过PCR鉴定ADAR2flox等位基因。为了选择性敲除ADAR2基因的活性部分，将ADAR2flox/flox小鼠与VAChT-Cre.Fast小鼠进行杂交获得AR2小鼠。将该转基因小鼠进行尾部组织PCR检测和脑脊髓组织反转录PCR检测、运动行为学观测、肌肉形态及腓肠肌电生理检测、脑脊髓神经元神经核形态学观察。AR2小鼠具有运动功能障碍、肌纤维萎缩、肌束震颤、选择性脑神经核变性等特点。同时也具有ALS患者的其他临床特征，包含运动神经细胞的逐渐凋亡、支配眼肌神经及决定运动障碍的运动单位组织不易被损伤等表现。
4.TDP-43转基因模型
（1）TDP-43转基因小鼠模型：有研究发现，绝大多数的ALS患者在受累神经细胞的胞浆内广泛存在泛素化、酸化的反式激活-反应性DNA结合蛋白-43（Transactivation-Responsive DNA Binding Protein-43，TDP-43）蛋白聚集体。王旭等依据上述理论，建立TDP-43突变转基因小鼠，初步证明TDP-43突变表达可以对小鼠的神经元及其运动产生影响，确定仅脊髓运动神经元的病理改变可以引发ALS的疾病进程。田田也依照上述理论，构建过量表达野生型人TDP-43（Wild-Type Human TDP-43，WThTDP-43）并在遗传上可控的转基因小鼠模型，并明确hTDP-43的过多表达可导致WThTDP-43转基因小鼠丢失前额叶皮质神经元。因此TDP-43转基因小鼠模型可作为进一步研究ALS的动物模型。
TDP-43转基因小鼠模型建立：获取编码人类TDP-43的cDNA后，剪切纯化目标DNA，将超数排卵的B6D2F1雌性小鼠和雄性小鼠交配获得受精卵。将目标合子通过显微注射，注射入受精卵。并将注射完成后的受精卵移植到假孕小鼠体内，出生后的小鼠与B6D2F1小鼠回交，产生F2代TDP-43转基因小鼠。对该小鼠模型进行PCR鉴定、行为学检测、免疫组织化学检测。该小鼠模型步态及抓握能力异常，具有前角运动神经元的胞浆内TDP-43包涵体特异性分布沉积、运动神经细胞形态改变、数目减少等表现。TDP-43转基因小鼠病理特征与ALS临床表现相似，可作为研究ALS的一种动物模型，但还需进一步研究TDP-43引起ALS的相关分子机制。
（2）TDP-43（M337V）ALS小型猪模型：但因为ALS啮齿类动物模型无法模拟出ALS患者的TDP-43在细胞质聚集的病理表现。为了研究细胞质累积TDP-43如何导致ALS的这一病理机制，王国昊通过建立的转基因TDP-43（M337V）ALS小型猪模型，发现该转基因猪模型有ALS患者类似的运动障碍，神经元凋亡和TDP-43聚集的病理特征，为深入研究TDP-43及ALS提供良好模型。
TDP-43（M337V）ALS小型猪模型建立：利用体细胞核转移技术，将目标基因转移到模型猪体内。目标基因是利用TDP-43结合的剪接因子PSF和NeuN来改造基因。由于TDP-43、PSF和NeuN在细胞质的异常聚集，导致机体掌握神经发育的NMHC Ⅱ-B基因的pre-mRNA异常剪接，使得转基因TDP-43（M337V）猪与ALS患者病理改变相似，在神经细胞胞浆内蓄积较多的NMHC Ⅱ-BdN30蛋白。该蛋白具有神经毒性作用，可导致小鼠神经细胞凋亡。转基因TDP-43（M337V）猪为进一步研究TDP-43相关致病机制提供良好模型。
（3）TDP-43基因突变其他模型：此外，根据TDP-43蛋白毒性建立的模型还有ALS线虫模型、TDP-43蛋白病果蝇模型、TDP-43转基因斑马鱼模型等，为深入探究其致病机制提供模型。
5.其他基因突变动物模型
还存在FUS（Fused-in-Sarcoma）、VCP（Valosin-Containing Protein）、ALSIN/ALS2（Amyotrophic Lateral Sclerosis 2）等基因的突变或敲除等啮齿类动物模型。
（1）FUS蛋白病动物模型
陈彦博构建野生型和突变体型FUS转基因果蝇模型。将转染后的DNA质粒转移进果蝇体内，经过杂交后，用PCR法鉴定出所需果蝇模型进行后续实验。该两种模型均表现为进行性退化、神经元轴突消失、形态异常等，但突变体型表达出更强的神经毒性。同时在两种模型的神经元中发现线粒体的异常改变，说明造成了线粒体的损伤。由于线粒体的运输功能障碍，导致神经元损伤的进行性加重且不可逆的特点，与ALS相关临床特征一致。研究发现，恢复线粒体运输功能只能延缓但不能阻止疾病进展。这为进一步研究FUS致病机制提供条件。
（2）ALS2转基因动物模型(https://www.daowen.com)
Francois等为建立了ALS2基因敲除（KO）小鼠和zALS2基因敲除斑马鱼两种模型。ALS2基因敲除小鼠模型出现了轴突运输障碍的轻度神经元变性现象。而zALS2斑马鱼模型具有严重的运动神经元紊乱及发育异常、游泳障碍等症状表现。通过RT-PCR法鉴定两种模型。实验中发现，存在于ALS2基因缺失小鼠以及野生型的幼鼠中枢神经元中的新ALS2转录基因，可以改善斑马鱼的运动神经障碍表现。因此推测这种新的ALS2 mRNA可以防止ALS2（KO）小鼠模型神经退行表现的加重，并且建立了可以调节ALS2模型运动障碍表现的严重程度的可能性。因此，ALS2转基因动物表型与ALS具有相似的表现，所以可以作为研究其致病机理及ALS发病机制的良好动物模型。
（二）重金属离子所致神经毒性动物模型
因为ALS的病因和发病机制未知，临床治疗效果不是很理想，因此建立一些其他能表现出ALS相关病理特征和临床表现的动物模型十分必要，为进一步明确ALS的发病机制提供帮助。
1.慢性镉中毒大鼠模型
因为镉离子对脊髓运动神经元的损伤作用机理与ALS的发病机制比较相似，所以有研究利用镉离子喂养大鼠致使其慢性镉中毒来建立ALS动物模型。谢武桃利用镉离子易进入人体且容易在体内蓄积，从而影响人的神经系统发育和造成损伤这一特点。并且其前期研究发现，重金属镉可在成年大鼠脊髓内蓄积从而造成脊髓运动神经元损伤。所以以成年大鼠为对象，建立慢性镉中毒的大鼠ALS动物模型。
慢性镉中毒大鼠模型建立：将健康成年大鼠随机分为两组：慢性染镉组和对照组。慢性染镉组大鼠喂以含镉去离子水，对照组大鼠喂以去离子水。喂养一段时间后进行大鼠行为学观察检测、神经肌电传导、含镉量测定、脊髓中酶活性等几个方面鉴定动物模型构建结果。慢性镉中毒大鼠模型表现出ALS临床表现，并发现在其脊髓组织中Cu2+-Zn2+-SOD酶活性降低，且在脊髓组织细胞内检测到丙二醛的含量增加，说明造成脊髓组织细胞的氧化损伤，导致运动神经元受到影响。同时，慢性镉中毒大鼠模型坐骨神经传导速度会减慢，证明镉对运动神经元的传导功能有损伤。基于以上临床表现和病理特征，镉中毒大鼠模型可作为研究ALS的动物模型。
2.铝中毒动物模型
铝作为重金属离子也对神经元细胞具有慢性的毒性作用，因此也可建立铝中毒ALS动物模型：Kihira等，在兔的枕大池中重复注射氯化铝溶液，发现兔脊髓的运动神经细胞出现明显水肿，神经细胞胞浆内存在大量神经微丝、游离核糖体和类脂质物质沉积。此模型与ALS患者的神经微丝毒性及运动神经元传导功能异常十分相似。
3.BMAA大鼠运动神经损伤模型
Duncan报道了β-N-甲氨基-L-丙氨酸（β-N-Methylamino-L-Alanine，BMAA）BMAA神经毒素的神经毒性作用，病理检查发现变性的运动神经细胞的染色体溶解现象，导致实验动物具有ALS和行为异常的表现。张瑜也通过建立BMAA损伤模型研究运动神经元的损伤及细胞自噬改变。
BMAA大鼠运动神经损伤模型建立：将新生大鼠随机分为两组：实验组和对照组。实验组大鼠于出生后第9和10周两天连续皮下注射BMAA，对照组皮下注射PBS溶液。大鼠养育4周后，每周都进行运动功能测评。大鼠鼠龄24周时，测定腓肠肌肌电图、观察腓肠肌形态学变化、大鼠脊髓运动神经元改变并观察脊髓和大脑运动皮层内相关的表达。结果，实验组大鼠从22～24周出现运动功能障碍，肌电图检查结果显示实验组大鼠的腓肠肌呈现失神经支配情况。因神经源性损害，腓肠肌有相应萎缩情况，脊髓前角运动神经细胞数量也明显减少。其中实验组的自噬小体和自噬底物标志物也明显高于对照组，说明BMAA会导致运动神经细胞自噬功能提高。
（三）免疫介导动物模型
Engelhardt等将牛的脊髓前角灰质粉碎后制成匀浆，作为一种抗原注入豚鼠体内，来建立自身免疫动物模型。其原理简单阐述，是因为牛的脊髓前角灰质作为一种抗原进入豚鼠体内，因为其体内免疫应答作用使豚鼠获得自身免疫性脑脊髓炎，并发生运动神经元的损伤。也可直接将抗脊髓前角运动神经元的单克隆抗体注射入豚鼠胫前肌来造模。该模型与人类ALS各方面相似，适合作为ALS动物模型。
1.牛脊髓前角灰质匀浆免疫豚鼠模型建立
将健康雄性豚鼠分为免疫组、免疫对照组和对照组。免疫组注射牛脊髓前角灰质匀浆（用PBS和福氏试剂作为溶剂），免疫对照组注射PBS和福氏试剂混合溶液，对照组注射PBS。免疫后观察豚鼠运动情况，进行肌电图检测。豚鼠结束免疫后，取材脑脊液，腓肠肌标本观察运动神经元数目及变性情况以及IgG的沉积与否，并测量脑脊液中氨基酸含量。成功免疫豚鼠模型会出现肢体萎缩瘫痪、肌张力下降等表现。肌电图示肌肉失去神经支配，运动神经元数目减少并发生变性。肌肉活检提示出现神经源性肌肉萎缩，血清中IgG增高并在运动神经元内沉积。免疫测定豚鼠脑脊液和血清中相关氨基酸含量发现，免疫组瘫痪豚鼠血清和脑脊液中谷氨酸、天冬氨酸与对照组相比增高，说明氨基酸的兴奋毒性作用可能在免疫介导的运动神经元损伤过程中发挥作用。
2.自发基因突变动物模型
Vps54基因自发突变的Wobbler小鼠ALS易感品系，是由于常染色体突变导致脊髓神经元退行性变，与ALS的神经元损伤和临床表现比较相似。尽管Wobbler小鼠创建时间较早，但此模型也被广泛应用。
3.过表达神经微丝动物模型
神经微丝异常沉积的动物模型也是ALS动物模型的一个重要组成部分。研究表明，ALS患者中的神经微丝水平（NF）是对照者的5倍，说明NF的异常沉积有可能导致ALS的发生，因此建立过度表达的神经微丝动物模型对了解其致病机理有一定作用。神经微丝是由轻链（NF-L）、中链（NF-M）、重链（NF-H）3个亚基组成。Lee等实验发现，当神经微丝轻链基因（NF-L）点突变时，动物模型可表现为人类ALS的临床症状。NF-L转基因小鼠模型运动功能异常，与ALS临床表现十分相似。出现前后肢进行性萎缩无力并逐渐加重，肌肉震颤，呈现神经源性萎缩的表现。在病理方面脊髓运动神经元数目减少，传导功能下降，神经元胞浆内神经微丝及异常磷酸化神经微丝大量沉积，伴随轴突肿胀。因此NF-L转基因小鼠可作为研究ALS的良好模型。
（张 林）