神经炎症、致病蛋白与肌萎缩侧索硬化症
（一）神经炎症与肌萎缩侧索硬化症的病程进展关系
研究发现，运动神经元的丢失过程是在神经元与细胞微环境的互动过程中发生的。胶质细胞活化、外周免疫细胞浸润、补体系统激活等免疫机制均参与发病，这一过程称为神经炎症。近年来，多项研究表明神经炎症在介导神经元损伤和疾病进展中起着至关重要的作用。ALS中有明显的炎性表现，在对ALS患者的尸检中也发现存在有小胶质细胞激活形态学的改变和细胞表面受体的表达。从在ALS死者大脑运动皮层及脊髓中发现免疫炎性反应相关细胞异常聚集，到认识到免疫炎性反应与ALS发病有关，经历了漫长的探索。最初，Charcot在ALS死者的脊髓侧索中发现存在神经胶质瘢痕，而神经胶质瘢痕是由星形胶质细胞增生形成，是中枢神经系统中炎性反应的结局。后来对ALS死者尸检时也发现，在皮质脊髓束及脊髓灰质的很多部位都存在大量星形胶质细胞。在出现临床症状的SOD1突变动物中，出现了明显的炎性反应。早期发病与星形胶质细胞相关，晚期则与小胶质细胞相关，且小胶质细胞在疾病早期就已发挥作用。自身免疫机制ALS与体液免疫密切相关。如通过对一系列ALS病例的研究发现，ALS患者血清中存在大量异常的免疫球蛋白、免疫复合物，以及IgA、IgE升高。抗神经元抗体研究表明，ALS患者的血清和脑脊液中有抗神经元结构成分抗体，且脑脊液中抗神经元抗体高于血清。
1.免疫屏障
ALS发病早期，神经系统的屏障功能破坏，出现血管通透性增加、毛细血管长度缩短、微出血以及屏障结构所必需的组分表达减低等表现。神经屏障功能破坏可能是疾病重要的起始因素。研究发现，在SOD1 G93A突变小鼠出现症状前，脊髓运动神经元中可见含铁血黄素沉积，血脊髓屏障内皮细胞紧密连接所需的ZO-1、闭合蛋白、密封蛋白5等水平下降。Win-kler等发现，使用药物损害SOD1 G93A鼠的血脊髓屏障后，脊髓内毒性物质沉积，起病时间提前，而使用药物修复后，起病时间推迟。Garbuzova-Davis等发现，将人骨髓造血干细胞移植到ALS模型鼠体内，可修复血脊髓屏障，增加髓鞘连接强度。表明保护神经屏障功能是ALS治疗的一个方向。
2.固有免疫细胞
小胶质细胞、星形胶质细胞、单核/巨噬细胞可参与固有免疫，影响运动神经元微环境，是ALS发病机制的主要环节。
3.星形胶质细胞
星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种，呈星形，它从胞体发出许多长而分支的突起，突起末端常膨大形成终足，彼此连接构成胶质界膜。星形胶质细胞具有许多复杂功能，包括调节细胞外神经递质浓度，发挥代谢或离子稳态功能，为神经元提供结构和营养支持，并且还有助于免疫反应。
星形胶质细胞在免疫和非免疫机制中都导致运动神经元损伤。与ALS相关的基因不仅在运动神经元（MNs）中表达，也在星形胶质细胞中表达。已有研究表明，体外和体内表达mSOD1的星形胶质细胞对携带mSOD1基因的胚胎干细胞（ESC）的MNs和正常MNs都具有毒性。但在此之间，表达mSOD1的星形胶质细胞选择性地导致ALS中脊髓MNs的死亡，但不导致脊髓GABA、背根神经节神经元或ESC衍生的中间神经元死亡。在星形胶质细胞中选择性沉默或阻断mSOD1基因或移植健康的星形胶质细胞，可以减弱星形胶质细胞介导的毒性和MNs的损失，从而延缓疾病进展和延长mSOD1小鼠的寿命。在ALS患者和动物模型中，星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白-1（兴奋性氨基酸转运蛋白-2）的表达减少，导致谷氨酸（Glu）兴奋性中毒。事实上，在散发性ALS病例的脑脊液中发现谷氨酸盐水平升高。而利鲁唑（一种TTX敏感的钠通道阻断剂，通过阻止钙内流而阻止谷氨酸释放）是目前唯一能在ALS患者中提供治疗效果的药物。星形胶质细胞还可以通过模式识别受体（包括TLR和甘露糖受体）促成免疫反应。在被激活后，星形胶质细胞可以分泌神经毒性因子和细胞因子，如C-X-X基序趋化因子10，C-C基序趋化因子配体2和IL-6，极大影响局部环境，具体机制有待明确。此外，最近研究表明，特别是在ALS中，星形胶质细胞可以通过产生许多有毒分子，如一氧化氮或过氧亚硝酸盐，导致运动神经元死亡。
虽然星形胶质细胞不是中枢神经系统中真正的免疫细胞，但它可产生机体固有免疫的物质成分。胶质细胞功能紊乱研究发现运动神经元周围胶质细胞对运动神经元变性有很大的影响。中枢神经系统的周围胶质细胞有小胶质细胞、星形胶质细胞，在中枢受伤后迅速被激活，释放毒性和炎性介质，使神经元和胶质细胞损伤。小胶质细胞与神经元、星形胶质细胞形成网络链接，生理条件下网络之间的相互作用构成有机的生存环境。正常的星形胶质细胞可参与神经递质传递代谢，它通过摄取突触间隙中的Glu和γ-氨基丁酸（GABA）用来合成神经元中的递质谷氨酰胺和GABA，减少突触间隙中的Glu浓度，进而减少Glu所引起的兴奋毒性。这些表明，Glu转运体的丢失是继发于胶质化反应的。胶质细胞还可通过主动释放Glu盐而引起神经元兴奋性毒性损伤，胶质细胞中的炎性改变可激发Glu盐的释放，因此可加剧神经元的兴奋性毒性。随着ALS患者SODG93A转基因鼠脊髓内增加的炎性介质及活化的星形胶质细胞和小胶质细胞的发现，人们开始注意到：突变的SOD1介导的ALS的发病过程并不局限在运动神经元，且涉及周围的胶质细胞。且在仅表达于神经元的突变SOD1小鼠中并未发现运动神经元的退行性病变。ALS中出现的炎性反应是有益还是有害的还未知。
在SOD1小鼠临床症状出现前，通过给予可抑制小胶质细胞激活的米诺环素处理可延缓疾病的进展。SOD1小鼠中的炎性反应由炎性介质介导，通过类似无菌性炎症样受体激活导致无菌性炎症。无菌性炎症可激活细胞凋亡蛋白酶1，进一步激活IL-1β。缺乏细胞凋亡蛋白酶1或者IL-1β或者通过IL-1受体拮抗剂处理过的SOD1小鼠表现寿命的延长。在动物模型中发现，神经毒性需要非神经元细胞中也要有突变人SOD1（hSOD1）的表达，实验表明，转基因小鼠中单纯地在神经元细胞或胶质细胞中表达突变的hSOD1不能引起运动神经元病的发生。在由正常和突变的SOD1共同表达的嵌合鼠细胞内，被突变SOD1表达的非神经细胞环绕的正常运动神经元表现出类似ALS的病理特点，而正常的非神经细胞使周围表达突变SOD1的运动神经元生存率提高。尽管表达突变SOD1仅限于星形胶质细胞或者小胶质细胞，并不足以引发疾病，但研究表明，与表达突变SOD1的神经胶质细胞共同培养的运动神经元的生存率减少。除此以外，在ALS患者血清中，可观察到TNF-α和可溶的TNF受体的增加。脊髓运动神经元在胚胎期会正常地表达p75NTR引起细胞的死亡，但是它的表达会在出生后停止，p75NTR及TrkA均不在成人的运动神经元中表达，但p75NTR会在轴突损伤及ALS中再次出现表达，在ALS小鼠模型中，退变的运动神经元重新表达p75NTR，其周围的反应性星形胶质细胞则表达神经生长因子（NGF），NGF在酪氨酸激酶受体（TrkA）缺失的情况下可与p75NTR结合，并可引起细胞的死亡。星形胶质细胞还有可能通过另外一种机制来影响神经元对兴奋性毒性的敏感性，钙离子渗透通过的抗毒覃碱样抗帕金森病药α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMAP）受体通过一种AMAP受体第二亚单位（GluR2）调控，GluR2可产生受体不利于钙离子的渗透，星形胶质细胞可上调共同培养的运动神经元细胞上的GluR2的表达，从而起到保护神经元细胞免受兴奋性毒性损害的作用，然而，若是在星形细胞中表达突变的hSOD1，则会下调GluR2，从而造成神经元细胞的损害。
4.小胶质细胞
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）抵御伤害和感染的第一道防线之一，占胶质细胞总数的5%～20%，具有免疫活性和吞噬功能。是先天性免疫系统的重要组成部分，其激活后产生先天免疫应答。小胶质细胞共分为M1型和M2型，一般而言，M1型被IFN-γ或脂多糖（LPS）激活，促进神经毒性T细胞反应，并且因其分泌的活性氧（ROS）和促炎因子（包括IL-1、IL-6和TNF-α），以及减少保护性神经营养因子的分泌而具有细胞毒性。相反，M2型具有保护作用，可释放高水平的抗炎细胞因子和神经营养因子，包括IL-4、IL-10和胰岛素样生长因子（IGF）-1，以及与其他神经保护信号分子如Fractalkine（CX3CL1）和CD200（OX2）等。
神经元通过表达膜结合蛋白和可溶性介质来调节小胶质细胞的活化，从而产生神经保护性或神经毒性。小胶质细胞神经保护作用主要由两种信号分子所承担：Fractalkine和CD200诱导因子。CX3CL1在应激状态下由运动神经元释放，与Fractalkine受体（CX3 CR1）结合，而小胶质细胞是表达Fractalkine受体的唯一细胞，故认为Fractalkine能激活小胶质细胞。向CX3 CR1小鼠注射LPS后发现小胶质细胞反应失调，同时去除mSOD1小鼠的CX3 CR1后观察到神经元丢失水平增加，这些研究证实CX3 CL1/CX3 CR1结合后的神经保护作用。CD200（OX2）信号似乎也在ALS发病机制中起关键作用，在CD200小鼠中，小胶质细胞从抗炎和神经保护转变为促炎和神经毒性，释放ROS和促炎细胞因子，导致神经元进一步损伤并启动细胞死亡。而在CX3 CR1小鼠中未观察到这些现象，表明CD200/CD200 R和CX3 CL1/CX3 CR1在小胶质细胞作用中具有不同的保护作用。体外实验发现，突变的mSOD1蛋白也能激活小胶质细胞，这可能是通过CD14（一种错误折叠蛋白的模式识别受体），因为CD14具有共同受体Toll样受体2（TLR-2）和TLR-4。与LPS类似，mSOD1能够与CD14结合，在使用针对TLR2/4或CD14的抗体或通过使用CD14小胶质细胞阻断该通路后，发现促炎细胞因子和自由基的产生减少以及从mSOD1G93A小胶质细胞释放IGF-1增加，从而减弱了神经毒性，增强了小胶质细胞的神经保护作用。因此，对小胶质细胞激活机制选择性增强或阻断，可能是潜在的治疗方式。(https://www.daowen.com)
通过CD14和TLR途径的小胶质细胞激活是ALS的神经病理学标志之一。有研究发现，在ALS患者中出现大量激活的小胶质细胞，利用电子发射计算机断层扫描（PET）显影，在ALS患者的运动皮质、额叶前部、丘脑和脑桥均观察到激活的小胶质细胞。随着研究进一步深入，ALS动物模型及ALS患者的病理变化均证实在ALS发病过程中存在小胶质细胞激活。ALS患者与相同年龄段的正常健康人相比，脑脊液中促炎因子含量升高。由此可见，在ALS的病理变化中存在炎性反应。ALS患者和突变转基因小鼠的脊髓中发现了很多小胶质细胞的激活因子，包括TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-1 α、IL-6和MMP-9等。许多因子是由激活的小胶质细胞自身所分泌，这些因子可以正反馈加强自身的活化，也可作用于邻近的小胶质细胞。Dahlke等在ALS小鼠模型的运动皮层中发现，有大量被激活的星形胶质细胞和分泌肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）等促炎因子的小胶质细胞，并在相同部位检测到了Caspase-3，因此推断，炎性反应在ALS中是通过促炎因子激活Caspase-3的途径引起运动神经元退变和凋亡的。CX3C能减少小胶质细胞的凋亡并促进其分裂增生。其他神经元来源的信号分子如神经细胞黏附分子（Neural Cell Adhesion Molecule，NCAM）和细胞间黏附分子（Intercellular Adhesion Molecule-5，ICAM-5）能改变小胶质细胞的性状。嘌呤、嘧啶也参与了神经元和小胶质细胞的相互作用。ATP能够诱导小胶质细胞的化学趋化，分泌炎症细胞因子包括IL-1β、IL-6和TNF-α，并激活NF-κB途径。运用cDNA（Complementary DNA）微阵列技术和RNA保护技术显示，大约80天时在突变脊索周围，大量炎症相关基因，包括iNOS、COX-2、MMP-9、IL-1、IL-6及TNF-α表达上调，它们大多数能促进小胶质细胞激活从而产生神经毒性。ATP作用于小胶质细胞膜上的嘌呤受体，诱导其复合膜电位、跨膜Ca2+内流和胞质内Ca2+浓度升高，并通过嘌呤受体可调节LPS诱导小胶质细胞IL-1的释放。
近年来，越来越多的证据强有力地说明小胶质细胞参与了ALS病变过程中运动神经元丢失的触发和病情的进展恶化。在高级脊椎动物的中枢神经系统中，星形胶质细胞通过一种叫作胶质化反应的形式来应对各种损伤，如创伤、感染、局部缺血和神经变性过程。小胶质细胞通过一系列的激酶和磷酸化反应对外界刺激产生应答。其中的MAPK途径包括4条通路：ERK1/2即p44/42，NKs/SAPKs，ERK5/（BMK1）和p38MAPK，这4条途径对外界刺激的应答不同。p38MAPK直接调节的激酶MK2在神经性炎症和神经变性疾病中具有相关作用，如诱导小胶质细胞的促炎性因子的释放，而在LPS和IFN-γ刺激下小胶质细胞中MK2的激活和表达将增加。虽然神经元分泌的激活信号现在还不是很清楚，但是活化的p38MAPK在运动神经元中的出现先于小胶质细胞，这意味着胶质细胞的活化反应与其周围受损的运动神经元分泌相关信号有关。一个参与它们相互作用的信号分子是神经元和星形胶质细胞表达的CX3C，其受体表达在神经元和小胶质细胞上。另有实验表明小胶质细胞因对其胞质中突变的SOD1蛋白产生应答而被激活，导致了胞内途径的激活和神经毒因子分泌增加。也有可能损害了小胶质细胞，从而阻止它们释放某些对神经元具有保护作用的因子。具有突变SOD1的小胶质细胞更容易被激活。选择性敲除小胶质细胞中的突变SOD1使得突变小鼠存活增加，这一现象证实了以上假设。
5.单核/巨噬细胞系统
单核/巨噬细胞系统是小胶质细胞的来源。Beers等选用敲除PU.1基因，巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和小胶质细胞缺失的G93A SOD1小鼠作为模型，植入SOD1G93A小鼠的单核/巨噬细胞后，疾病迅速进展，而植入野生型小鼠的单核/巨噬细胞后，病程显著延长。SOD1突变的小胶质细胞可产生更多的过氧化物和氮氧化物，有神经毒作用。在周围神经系统及神经肌肉接头处，巨噬细胞也发挥同样的作用。Van Dyke等发现，在出现症状的G93A SOD1小鼠中，肌组织含有较高水平的单核/巨噬细胞标志物及炎性因子，在神经肌肉接头处，巨噬细胞标志物胶质细胞原纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）含量增高。表明单核/巨噬细胞系统广泛参与中枢和周围神经的神经炎症。
（二）免疫机制与肌萎缩侧索硬化症的关系
文献报道，血清中有20种抗原可与ALS患者产生的高活性IgG结合，且这20种血清抗原鉴别ALS的特异度达100%，敏感度达99.9%。ALS患者血清或脑脊液中抗运动神经元抗体可与运动神经元细胞膜的电压门控Ca2+通道结合，引起胞浆及轴突末梢Ca2+水平升高，进而导致运动神经元的损伤及凋亡。实验通过对抗体、T细胞、趋化因子、细胞因子和其他炎性标志物的研究表明ALS中出现有异常的炎性反应，ALS中存在钙离子电压依赖性通道抗体，IgG的水平升高。
T细胞介导的细胞免疫在ALS中的作用
ALS不但与体液免疫有关，而且也与细胞免疫异常有关。ALS患者血液中有CD4+辅助细胞的增加和单核细胞及巨噬细胞中人类白细胞抗原（HLA）Ⅱ类分子的表达增加，有白细胞介素（IL）-13，它可产生T细胞并且和疾病的进展相关。这些研究均表明此类炎性反应在SOD1小鼠中会加重疾病。同样有证据表明保护性免疫机制可减轻疾病。炎性反应的保护作用包括小胶质细胞清除碎片和与T细胞交联。大脑特殊的T细胞可能通过释放的细胞因子和生长因子在损伤部位发挥修复损伤炎性组织的作用。
在疾病发展过程中，特定的T细胞亚群进入CNS并促进ALS的神经炎性反应。来自ALS患者的尸检样本中观察到CD4+T细胞、CD8+T细胞、激活的小胶质细胞、星形胶质细胞以及由浆细胞产生的IgG沉积物在脊髓中显著积累，提示T细胞参与疾病的免疫反应过程。ALS患者脑脊液中克隆出来的T细胞可被诱导产生干扰素。在ALS中也有循环的趋化因子和组织因子的增加，脂多糖水平、C3的升高。此外，其他炎性因子也可出现异常。随着研究不断深入，ALS与自身免疫的关系正逐步明显，但是目前临床上应用免疫抑制剂治疗ALS并未取得明显疗效。
值得注意的是，在G93A SOD1ALS小鼠研究中发现，转基因鼠体内受损的运动神经元可招募免疫细胞而延缓肌肉的去神经化。可见，免疫反应在ALS病程中的作用并不是单一的。这种保护性的免疫反应作为一种自我平衡调节很普遍的存在。小鼠出现症状后观察到脊髓中CD4+和CD8+T细胞大量浸润，表明了T淋巴细胞参与早期疾病发生发展事件。为了解T淋巴细胞对疾病的作用，有研究将G93 mSOD1小鼠的RAG-2基因敲除（缺乏功能性T细胞和B淋巴细胞的重组激活基因2），发现仅表达突变的SOD1且缺乏功能性CD4+T或B细胞的小鼠表现为胰岛素样生长因子（IGF-1）的缺乏和IL-6的下调及促炎性趋化因子和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶2（NOX2）的增加。在ALS血清中发现有IL17、IL-6的升高，疾病进展加速，寿命缩短，但不影响疾病的发生，提示T或B淋巴细胞在疾病发生发展中具有保护作用。另外，与G93A SOD1/RAG2-/-小鼠相比，敲除T细胞表面的CD4（CD4-/-）的G93A SOD1小鼠显示出更短的生存期，因此可推测CD4+T细胞与延长疾病持续时间和生存期有关。除此之外，与G93A SOD1/RAG2+/-或G93A SOD1/CD4+/-小鼠相比，在疾病末期，G93A SOD1/RAG2-/-和G93A SOD1/CD4-/-小鼠检测到较少的活化的小胶质细胞，同时，小鼠脊髓中神经营养因子（包括IGF-I、GDNF、BDNF）和抗炎因子的mRNA水平降低，CX3 CR1和几种谷氨酸受体水平也降低。研究发现：通过骨髓移植，上述因子的水平恢复，提示CD4+T细胞能改变ALS中小胶质细胞和星形胶质细胞的活化状态，并且可以通过调节神经保护和细胞毒性之间的平衡来保护运动神经元。由于大量运动神经元和轴突在症状出现时仍保持完整，免疫系统的作用可能是保护这些剩余的神经元免于退化。
（三）TDP-43致病蛋白与肌萎缩侧索硬化症的关系
ALS的遗传病因的阐明为细胞内神经元退化的潜在机制提供了基础，同时促进了疾病模型的建立，靶向疗法的设计和测试，因此研究者们一直致力于寻找致病突变。1993年，SOD1突变被鉴定可以导致家族性ALS，但是直到2008年才发现ALS的下一个致病基因TARDBP（编码TDP-43蛋白）。
TDP-43是一个进化上保守的RNA/DNA结合蛋白，在ALS和FTD中都发挥着关键作用。FTD是继AD后第二个最常见的早期发作的痴呆，这个疾病是由于额叶和颞叶皮层神经元进行性的丢失引起的，导致语言、行为和性格的改变，后期引起广泛的心智能力的下降；ALS是一个快速的进行性神经退行性疾病，主要是由于运动皮层和脊髓前角的运动神经元受损，导致严重的肌肉萎缩，最终完全瘫痪；尽管FTD和ALS在临床上有这些差异，但它们还是被认为是密切相关的两个疾病，2006年ALS-FTD分子水平的联系进一步加强，在大部分的ALS和FTD患者中，TDP-43蛋白被发现是泛素阳性内含物的主要成分，2008年发现罕见的TDP-43杂合错义突变引起常染色体显性的ALS，它们典型的特征是含有TDP-43阳性的内含物，确定了TDP-43主要的致病作用，然而，在大部分ALS和FTD患者中，仅仅出现TDP-43内含物，而没有TDP-43突变，此外在ALS-FTD中，其他基因如PGRN、VCP和C9orf72的突变也会引起TDP-43内含物的形成，然而到目前为止机制还不清楚。
在正常情况下，TDP-43在神经元核中表达，核TDP-43最重要的功能是对RNA的调节，包括mRNA的剪切、转录、运输以及稳定等过程。在ALS-FTD患者的神经元胞质中可以发现典型的TDP-43阳性的内含物，并伴随着正常的核蛋白的丢失，因此胞质获得性功能和核的丢失性功能的机制分别被提出，然而，根据不同的物种包括线虫、果蝇、鱼和啮齿类动物的研究，发现TDP-43核的丢失功能，而不是胞质毒性聚集的获得性功能，是TDP-43相关蛋白病理的关键因素。神经退行性疾病包括ALS在内的一个典型特征是神经元中含有泛素阳性的内含物，因此蛋白质聚集的形成和降解的研究有助于我们进一步了解ALS的病理，由于神经元不能通过有丝分裂增殖，因此毒性的聚集蛋白的清除对神经元的存活是非常重要的。虽然泛素蛋白酶体系统缺陷或自噬缺陷都可以引起ALS相关蛋白异常聚集，但是现在越来越多的证据表明自噬是细胞内聚集降解的主要途径，并且是促进神经元生存的最主要通路。自噬是一个通过溶酶体降解细胞内蛋白质或细胞器的保守过程，在细胞的生长和发育过程中起着重要作用，尤其在应激的情况下可以维持细胞内稳态。有研究表明自噬很可能是ALS发病的一个起因，在尸检后的ALS患者和动物模型的脊髓运动神经元中，自噬相关的标志物水平都是增加的，但是同时ALS相关蛋白包括SOD1和TDP-43聚集的形成又表明自噬功能发生了障碍，此外，通过遗传途径或Rapamycin增强自噬水平可以构建不同的神经退行性疾病模型，而在其他神经退行性疾病如亨廷顿病（HD）中诱导自噬可以降低异常蛋白的聚集，并且缓解了疾病的进程，因此，自噬对ALS疾病进程的影响是非常重要的。