肌萎缩侧索硬化症的细胞模型构建
肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）是最常见的神经退行性疾病，选择性侵犯脑与脊髓的上、下运动神经元，又称葛雷克氏症。临床表现为进行性肌肉无力、肌肉萎缩、患者晚期瘫痪，常伴有轻度记忆和认知功能损害，发病年龄一般在35～50岁之间。目前关于ALS的发病机制仍然没有确定的结论，可能涉及多种不同的细胞损伤机制：氧化应激反应、谷氨酸兴奋性毒性、蛋白质的异常积累、线粒体功能的失常、遗传因素、缺乏神经营养因子、细胞凋亡等。
（一）稳转TDP-43的NSC-34细胞模型构建
伴随着越来越多的学者在ALS患者的运动神经元、胶质细胞的胞浆和胞核中，发现主要成分是TAR DNA结合蛋白（TDP-43）异常泛素化的蛋白聚集体，越来越多的学者在关于ALS致病机制研究的实验中，将研究的对象设置为TDP-43。TDP-43是由1号染色体上的TARDBP基因中的6个外显子编码，具有414个氨基酸的核蛋白，具有一个富含甘氨酸的C-末端和2个RNA识别序列，该结构使他它以结合单链DNA，主要负责RNA代谢的调节。TDP-43富含甘氨酸的末端可被截断，形成的25kD、35kD、TDP-25、TDP-35都具有细胞毒性，其中TDP-25的毒性是最强的，通过获得性毒性损伤神经元，诱导细胞死亡。而神经母细胞瘤与脊髓杂交细胞系43（NSC-43）是具有很多运动神经元特性的杂交细胞系，通常生长在37℃、含5%CO2的空气环境中。所以在针对研究ALS的实验中常常使用稳定转染突变的TDP-43的神经母细胞瘤与脊髓杂交细胞系34（NSC-34）作为ALS细胞模型，例如鲁金胜等的实验。
实验方法
突变TDP-43稳染实验方法主要包括NSC-34的细胞培养、细胞转染和细胞系的复苏、传代、冻存细胞收集和免疫印迹法检测蛋白。
NSC-34细胞用含有10%胎牛血清的DMEM（含青霉素、链霉素）进行培养，2～3天更换培养基，等到细胞生长状态良好后，使用0.25%EDTA胰酶进行消化操作，经过离心、沉淀、重悬、血细胞计数板观察细胞融合状态，待融合率达到80%～90%时，用脂质体进行质粒转染。首先设置空质粒pCI-neo（含GFAP）进行转染条件的摸索，找到最佳转染比例后，用同样的方法铺板、观察细胞融合率，待到80%～90%时将静置后的质粒［含有人正常（WT）、M337V、或Q331K突变TDP-43 pCI-neo］和Lipo2000溶液混合物滴入培养基（待转染细胞的培养液不含抗生素），转染后进行换液，换成含有抗生素G-418的培养液，筛选细胞，G-418是一种氨基糖苷类类似物，结构与新霉素、卡那霉素、庆大霉素结构相似，主要通过干扰核糖体功能组织哺乳动物蛋白质的合成。将耐G-418抗生素的各细胞系分离、培养、传代、冻存。转染48小时后收集细胞，采用BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度，Odyssey红外图像进行扫描分析以及半定量分析，免疫印迹法检测细胞稳定转染的蛋白的表达水平。所转染的TDP-43蛋白均带有HA标签，因此HA抗体也可以用来检测细胞内外源性TDP-43表达情况。稳转突变TDP-43的NSC-34细胞模型是否成功建立，需要通过Western Blot法检测细胞中是否有突变TDP-43蛋白的表达，如果有则表明选用的细胞是稳转TDP-43的NSC-34细胞，成功建立ALS的细胞模型。
（二）稳定表达hSOD1-G93A的细胞模型构建
ALS分为家族性ALS（Family ALS或fALS）和散发性ALS（Sporadic ALS或sALS），1993年Rosen等发现SOD1基因突变导致fALS，这一发现对研究ALS发病机制产生重要影响。SOD1（Cu/ZnSOD、铜/锌超氧化物歧化酶）是一种重要的金属酶，主要功能是清除线粒体呼吸过程中产生的自由基，是生物抵抗氧毒性的关键因子。人体的SOD1的基因组DNA长12kb，有5个外显子编码共153个氨基酸，结构式同源双聚体。SOD1-G39A基因是SOD1基因序列中第281位的G突变为C，引起蛋白序列中第93位的甘氨酸（G）突变为丙氨酸（A）。突变产生的SOD1蛋白具有获得性毒性功能，损伤神经元的结构和功能，加剧细胞氧化应激损伤反应，SOD1基因突变产生的SOD1蛋白异常折叠而形成蛋白质的异常聚集可能启动ALS的发生。VSC4.1是小数的N18TG2神经母细胞瘤和大鼠脊髓腹侧运动神经元杂交得到的细胞系，经过低血清分化后可作为研究运动神经元病变的细胞模型。
1.实验方法(https://www.daowen.com)
建立稳定表达hSOD1-G93A细胞模型的实验方法包括VSC4.1细胞的培养、质粒扩增与鉴定、VSC4.1细胞的转染和筛选培养。质粒扩增与鉴定时，将pCI-neo-Vector、pCI-neo/WT-SOD1、pCI-neo/G93A-SOD1常规转化感受大肠埃希菌DH5α，涂布于固体培养基，在合适环境下培养一晚后，挑去生长状态良好的菌落扩增、离心、提取质粒、测序，提取的质粒测序后结果与NCBI网站的hSOD1的cDNA比对，如质粒hSOD1-WT的插入序列与之完全相同，质粒hSOD1-G93A在第93号密码子由GGT变成GCT，编码蛋白也发生相应变化，则表示质粒构建成功。VSC4.1细胞转染时寻找Superfect转染试剂盒说明书进行操作，分别转染PCI-neo-Vector、pCI-neo/WT-SOD1、pCI-neo/G93A-SOD1。转染后使用G-418对细胞进行筛选，对G-418抗性克隆进行扩增，提取蛋白，用Western Blot法鉴定，并使用免疫荧光方法对VSC4.1进行运动神经元标志物检测，主要检测神经突起相关蛋白和细胞分化前与细胞分化后的运动神经元特异性标志物的表达。当观察到细胞生长汇合度达到80%时，使用Western Blot检测hSOD1表达水平。
2.标志物鉴定
VSC4.1细胞系运动神经元标志物的鉴定结果显示分化前后的细胞胞质中皆可发现Class β-Ⅲ-tubulin，且分化后的细胞突起染色可见神经微管相关蛋白MAP2与神经丝蛋白NF200。
相比于VSC4.-1-mock，NSC4.1-hSOD1-WT细胞呈多角形，细胞突触数量多，VSC4.1-hSOD1-G93A细胞体积小又圆，突出数量少。
Western Blot检测结果表明NSC4.1-hSOD1-WT和VSC4.1-hSOD1-G93A中有外源性hSOD1的表达，但VSC4.-1-mock中没有，表明了转染成功，该细胞模型也可应用于肌萎缩侧索硬化症的研究实验中。
该模型也可用NSC-43细胞代替VSC4.1细胞，NSC-34细胞转染和筛选后细胞形态学的结果显示转染hSOD1-G93A-pcDNA3.1（-）质粒的细胞与正常NSC-34细胞相比，细胞体变圆，突起减少，轴突变短。而转染pcDNA3.1（-）和hSOD1-WT-pcDNA3.1（-）的细胞较正常NSC-34细胞无明显变化。RT-PCR鉴定结果显示正常细胞组和转染空载体细胞未见阳性条带，稳定转染hSOD1-WT-pcDNA3.1（-）和hSOD1-G93A-pcDNA3.1（-）质粒的NSC-34细胞组可见阳性条带。应用鼠SOD1（mSOD1）引物进行RT-PCR，结果显示4组都出现了mSOD1基因的阳性条带。因此，可以证明hSOD1基因在NSC-43细胞系中成功表达。
也有研究表明能导致fALS的人体SOD1的113T突变在酵母细胞中也可获得有毒功能，使其形态发生急剧变化，表明了细胞周期被严重地扰乱。然而其他A4V、G41D、G41S、G85R、G93C突变也都对酵母细胞的提及产生的影响，但没有113T如此快速、剧烈的形态变化和死亡。酵母是单细胞微生物体，与真核生物体的动物有很多相同之处。该实验主要针对酵母细胞容易被基因试验方法操作、繁殖生长周期短、和人体在生物化学上有众多相似之处的特点，构建ALS细胞模型。
（张 林）