融合现代医学的细胞模型建立
细胞模型在体外进行诱导和建立，与动物模型相比较，具有可避免各种干扰因素实验条件轻易控制等优点。目前建立的细胞模型主要涉及神经细胞、神经胶质细胞、非神经细胞、基因工程细胞和杂交组织细胞五大类。细胞模型主要模拟淀粉样蛋白沉积、神经原纤维缠结形成、神经递质代谢异常和神经细胞能量代谢异常。
（一）AD细胞模型可供选择的造模试剂
1.神经毒性损伤
（1）Aβ：Aβ来自其前体淀粉样蛋白前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP）第672～711残基裂解片段，APP经β-分泌酶和γ-分泌酶连续剪切后形成长度在39～42个氨基酸的短肽。APP表达量增多时，导致Aβ过量产生，从而造成Aβ积聚形成老年斑（Senile plaque，SP）。据报道，Aβ可直接或间接对线粒体结构及功能造成损伤，进而诱发氧化应激、激活凋亡信号通路等级联反应，导致大量的神经元细胞损伤。此外，Aβ积聚也会导致Tau蛋白过度磷酸化、突触连接障碍、炎症反应等。目前研究常采用20μmol/L浓度的Aβ1～42、Aβ25～35，诱导细胞建立AD细胞模型。
（2）谷氨酸：谷氨酸（Glutamate，Glu）是大脑中主要的兴奋性神经递质，同时也被认为是新皮质和海马锥体神经元的主要神经递质，涉及认知功能等方面。研究表明，谷氨酸能神经元位于AD中受影响的区域，其作用是通过控制突触中谷氨酸的浓度，将神经冲动转化为化学刺激，并在突触前神经元中通过2个囊泡谷氨酸转运蛋白VGLUTs（Vesicular glutamate transporter，VGLUTs）1和VGLU2维持储存在囊泡中的谷氨酸水平。当神经元去极化时，过量的谷氨酸被释放到突触间隙，导致突触前和突触后神经元上的谷氨酸受体过度刺激，造成钙大量涌入、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）产生，引起氧化应激反应及最终的神经细胞死亡。目前谷氨酸常采用10μmol/L的浓度诱导细胞建立AD模型。
（3）甲醛：甲醛（Formaldehyde，FA）是毒性最强的有机化合物之一，广泛分布于生物体和环境中。研究发现，AD患者尸检的海马中FA水平显著升高，因此AD的发病机制与甲醛密切相关。文献报道FA异常升高与认知障碍有关，如学习能力下降和记忆丧失；其也可促进AD的主要病理特征形成，包括Aβ沉积、Tau蛋白过度磷酸化和神经元丢失，同时伴有细胞功能障碍甚至细胞凋亡。研究采用0.35mmol/L的FA诱导N2a细胞，导致细胞凋亡率增高，Tau蛋白过度磷酸化。
（4）甘油醛：甘油醛（Glycid aldehyde，GA）呈剂量依赖性地促进神经细胞中GA衍生晚期糖基化终末产物（GA-AGEs）的产生。GA-AGEs主要存在于海马和海马旁回的神经元中，具有强烈的神经毒性，研究表明，经0.7mmol/LGA诱导的SH-SY5Y细胞出现凋亡；另外，细胞内产生GA引起甘油醛-3-磷酸脱氢酶失活，进一步增加SH-SY5Y细胞内GA浓度，导致GA-AGEs产生和神经细胞毒性增强。
（5）硅胶纳米粒子：硅胶纳米粒子（Silica nanoparticles，SiNPs）是工业中使用最广泛的纳米粒子之一，并且已经用于中枢神经系统中的细胞和非病毒基因的递送。研究表明，SiNPs具有神经毒性，可诱导SK-N-SH和N2a细胞凋亡，并提高细胞内ROS水平；另外，经SiNPs处理的细胞内Aβ沉积增加和Tau蛋白Ser262和Ser396磷酸化。
2.氧化应激损伤
（1）过氧化氢：H2O2是一种强氧化剂，可诱导体外细胞产生ROS，抑制细胞增殖，并氧化脂质、蛋白质和DNA等细胞内大分子，产生过量的脂质氧化物及自由基等，导致组织损伤和细胞死亡。此外，研究显示H2O2可通过c-JunN-末端激酶诱导β-分泌酶的启动子活性，导致APP表达增加和Aβ积聚，从而诱导神经细胞凋亡。
（2）晚期糖基化终末产物：晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）主要是由蛋白质等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过非酶促糖基化反应产生不可逆的终末产物。AGEs积累后能诱导神经元产生大量ROS，从而引发氧化损伤；同时，高水平的AGEs和ROS将导致AGEs受体（Receptor for advanced glycation end products，RAGE）过表达。AGEs与其受体RAGE结合是其致病的主要途径，两者相结合后，通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶产生ROS，增强机体氧化应激，最终导致神经元凋亡。此外，AGEs累积也与炎症反应、细胞凋亡等机制相关。
3.Tau蛋白过度磷酸化
大量研究证明，Tau蛋白过度磷酸化在AD疾病中起着重要作用。冈田酸（Okadaic Acid，OA）是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化。体外研究表明，经OA处理的神经细胞，Tau蛋白Ser-262位点磷酸化水平明显升高；同时，OA具有神经毒性，引起神经元细胞突触损伤。因此，OA可用于制备Tah蛋白过度磷酸化的AD细胞模型。
（二）细胞模型
1.神经细胞模型
（1）A β蛋白诱导神经元细胞：传统的AD细胞模型的制备是在神经细胞培养过程中加入有细胞毒性作用的Aβ，通过检测干预细胞的细胞活力、细胞凋亡和相关炎性指标判断AD模型的成功与否。
①研究表明海马神经元的大量凋亡与阿尔茨海默病患者认知功能障碍密切相关，并且AD发病时有较多且毒性强的Aβ1～42产生。因此应用不同浓度Aβ1～42诱导SD大鼠原代海马神经元可以建立稳定阿尔茨海默病细胞模型。同时原代海马神经元的培养及Aβ蛋白诱导海马神经元建立阿尔茨海默病细胞模型的方法具有经济、适用、重复性高等特点。
现常用β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导细胞反应建立AD模型。方法：分离并培养新生24小时内SD大鼠原代海马神经细胞；加入Aβ1～42诱导，诱导后采用MTT法观察细胞活力，选取理想Aβ1～42诱导的海马神经细胞作为阿尔茨海默病细胞模型；结论：Aβ1～42可导致海马神经元大量凋亡；Aβ1～42浓度为20μmol/L诱导的SD大鼠海马神经元可作为理想的阿尔茨海默病细胞模型。(https://www.daowen.com)
②Aβ25～35诱导N2a细胞24小时，与对照组比较，Aβ诱导的AD细胞模型在细胞活力、细胞凋亡和相关炎性因子表达等方面都有差异（P＞0.05），说明模型建立成功。
③HT22细胞是HT4细胞的亚克隆，为一种永生化的小鼠海马神经元细胞，具有生长稳定、易获得的特点。在体外研究的情况下，分化液处理后的HT22细胞，轴突、树突变得更长，细胞更接近体内海马神经元的状态。并且Aβ25～35可以诱导分化组HT22细胞发生损伤，且呈剂量依赖关系。因此可应用β-淀粉样蛋白（Aβ25～35）诱导HT22细胞建立阿尔茨海默病（AD）细胞模型。
建模方法：将HT22细胞分为未分化组和分化组，未分化组加入完全培养基培养48小时，分化组为完全培养基贴壁生长24小时后加入分化液（Neurobasal培养基和N2添加剂）培养24小时，Western印迹检测两组细胞ATF6、PERK、IRE1蛋白表达量的变化。实验结论为：A β 25～35（20μmol/L）诱导分化型HT22细胞可建立最佳AD细胞模型。衡量指标为：MTT检测细胞活力时，加入抑制细胞生长类药物后，细胞存活率为60%～80%时，细胞模型建立成功。
（2）OA诱导p-Tau细胞模型：蛋白磷酸化异常是AD的重要病理特征，以Tau蛋白为靶标的药物设计也可成为研发治疗AD药物的重要生长点。OA可间接激活有丝分裂原激活蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶，这两种酶可使Tau蛋白磷酸化。因此，用OA直接诱导PC12细胞凋亡可建立具有代表性的AD模型。常用实验方法如下：
①PC12细胞培养条件，高分化PC12细胞加入体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37℃体积分数5%CO2孵箱中进行培养，每2天换液1次，待细胞长至80%接触时用体积分数0.25%胰酶消化，1∶3分瓶传代。
②建立Tau磷酸化AD细胞模型：培养好的PC12细胞换含175nmol/L的冈田软海绵酸（Okadaicacid，OA）的培养基，分别对比作用不同时间（4小时、8小时、16小时、24小时和48小时）建立适宜的Tau磷酸化AD细胞模型。对照组加入体积分数0.001%DMSO（与最终OA溶液中DMSO浓度一致）。衡量指标：与空白对照组比较，模型对照组的p-Tau显著增加（P＜0.01），这说明该细胞模型符合AD中p-Tau过度表达的病理特征，即该AD细胞模型制备成功。
2.转基因细胞模型
阿尔茨海默病（AD）分为家族性AD和散发性AD，家族性AD的发病与APP、PS1、PS2基因突变直接导致Aβ产生过多有关；散发性AD是遗传缺陷如基因突变、环境因素如细胞氧化应激损害等因素共同作用的结果，Aβ沉积可能只是这些因素作用后的结果，而非病变的启动环节。因此，传统的Aβ诱导的AD细胞模型可能仅适合于对家族性AD的研究，散发性AD细胞模型的制备更需要考虑由后天因素如基因突变、环境改变等所致的Aβ增多。
而转基因细胞模型在前人研究的基础上克隆相关基因，设计并克隆突变体和基因，使用真核表达载体，转染人神经胶质细胞瘤细胞株，观察细胞株形态的变化和含量的变化，并对突变体可能的作用机制进行探讨，为以后研究分子机制提供了分子和细胞基础。
以往的研究认为：SORL1表达降低，APP向Aβ生成增多，导致Aβ的异常沉积，从而增加AD发病的风险；但近年的研究发现SORL1还可能通过影响Tau相关蛋白、炎症相关物质及神经营养因子等多种物质的代谢或转运参与AD的发生和发展。由于SORL1化学结构的复杂性决定了其功能的复杂性。SORL1作为细胞内分选受体可在高尔基体（TGN）、细胞表面、神经元和多种细胞器之间穿梭，参与多种物质在细胞内的转运和代谢。年轻时（未出现AD症状前）的SORL1基因突变导致脑组织结构的改变和以后几十年AD的易感性，说明了SORL1减少可能是散发性AD发病的始动环节之一，即：减少细胞内SORL1的表达可能使细胞出现AD样的病理改变，敲低细胞内SORL1的表达就可能建立一种更贴近于散发性AD始发病理改变的细胞模型。
SORL1敲低细胞模型的构建：RNA干扰慢病毒载体及空病毒载体分别传染给N2a细胞，采用qRT-PCR和Westernblot检测和鉴定细胞内SORL1转染的成功。AD细胞模型研究存在许多局限性，如无法检测主要存在于细胞外的Aβ或无法显现AD所有的病理改变。
3.常用细胞建模
（1）神经母细胞瘤细胞：人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH和SH-SY5Y常用于研究AD发病机制。SK-N-SH细胞系来源于一名4岁女性的转移性神经母细胞瘤的骨髓活检组织，该细胞系在体外培养状态下的生长特性类似神经元，具有神经元酶表达的多能性，如多巴胺-β-羟化酶、胆碱乙酰转移酶（Choline Acety ltrans ferase，ChAT）、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶。同时，研究表明SK-N-SH细胞经10μmol/L全反式维A酸诱导分化后细胞突触明显伸长、突触素表达明显升高等典型的神经元特征。而SH-SY5Y细胞系应用最为广泛，是SK-N-SH细胞系的一个亚系，并经历3次克隆选择产生（SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y）。该细胞系表现出多巴胺能神经元的特性，可表征多巴胺能标志物，如：多巴胺-p-羟化酶、酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxyase，TH）和多巴胺转运蛋白，具有合成和降解多巴胺的能力；同时，该细胞经诱导剂维A酸诱导分化后，引起多巴胺能神经元特征加强，具有高表达的囊泡单胺转运体1（Vesicular monoamine transporter，VMAT1）、多巴胺受体D2（Dopamine receptor D2，DRD2）。目前，常用于诱导人神经母细胞瘤细胞建立AD模型的造模试剂包括：AB、H：0：、AGEs、GA、OA、siNPs等，其诱导时间大多为24h或48h。该类细胞模型主要体现AD疾病的细胞凋亡、氧化应激、Tau蛋白磷酸化等病理特征。
（2）NG108.15细胞株：NG108.15细胞株是由小鼠神经母细胞瘤（Neuroblastoma）和大鼠神经胶质瘤（Glioma）细胞杂交形成的神经肿瘤细胞。Tojima等发现该细胞株经分化剂丁酰环磷酸腺苷（Dibutyryl cyclic Adenosine monophos phate，db-cAMP）刺激分化后，表现出神经元样形态，具有神经突结构；同时，通过比较研究发现未分化和分化的NG108-15细胞株均能不同程度地表达神经元蛋白和神经胶质蛋白，但未分化的细胞仅能表达神经胶质蛋白，如波形蛋白，而极少表达神经元蛋白，如神经丝蛋白（neurofilament potein，NF）200、磷酸化NF200，因此认为未分化的NG108-15细胞株不是神经元样细胞；此外，分化后的NG108-15细胞株也能表达ChAT蛋白，揭示该细胞能合成神经递质乙酰胆碱。NG108-15细胞株常应用于AD等与认知、记忆相关的体外研究。研究常采用Aβ25～35、OA。等诱导NG108-15细胞株，其模型主要机制涉及细胞凋亡、Tau蛋白异常磷酸化等，与AD患者脑组织中的病理特征一致，可作为研究AD的细胞模型。
4.疾病特异性诱导性多功能AD细胞模型
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）患者和认知正常人的血细胞重编程为诱导性多功能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs），进一步诱导为神经干细胞和神经元，观察不同来源iPSCs向神经干细胞和神经元分化能力的差别及细胞凋亡情况。
方法：将散发性AD患者和认知正常人来源的外周血细胞重编程为iPSCs，进一步诱导为神经干细胞和神经元，应用IncuCyteZOOM动态细胞观察系统记录分化过程中细胞生长曲线，应用免疫细胞荧光实验对诱导得到的神经干细胞和神经元进行鉴定，采用TUNEL原位末端标记法检测诱导得到神经干细胞和神经元的细胞凋亡情况。
结果：经过7天诱导，iPSCs可分化为神经干细胞，AD患者和认知正常人来源神经干细胞均可表达神经干细胞标志物Nestin、Sox1、Sox2、Ki67。AD患者来源的神经干细胞的生长曲线低于认知正常人。增殖标志物Ki67染色结果显示，AD患者和认知正常人来源神经干细胞中Ki67阳性细胞比例没有显著差异，TUNEL检测结果显示AD患者来源神经干细胞中TUNEL阳性细胞显著多于认知正常人（P＜0.001）。
结论：AD患者来源神经干细胞向神经元分化时分化速度大于认知正常人iPSCs诱导的神经干细胞，且分化的神经元凋亡多于认知正常人。由AD患者iPSCs诱导得到的神经干细胞和神经元凋亡增多，与AD患者大脑中神经细胞丢失的病理特征相似，提示其可以作为一种研究AD发病机制及药物筛选的模型。