6.1.4 膀胱类器官的应用与展望
与常见的2D平面培养细胞不同，膀胱类器官以其独特的3D结构特征与优势在膀胱癌、细菌感染模型的构建以及组织发育再生等研究领域有着广泛的应用。
1.膀胱肿瘤特征研究
膀胱癌是最常见的一种泌尿系统恶性肿瘤，在我国泌尿生殖系统肿瘤发病率中排第1位。膀胱癌在男性中发病率更高，我国男性膀胱癌发病率在男性癌症发病率中位列第7。国际癌症研究机构（IARC）数据显示，2020年全球新增癌症病例中膀胱癌位列第12。膀胱癌可发生在任何年龄，发病率随年龄增长而升高，多发于50～70岁。膀胱癌主要分为非肌层浸润型膀胱癌与肌层浸润型膀胱癌两大类，同时有近一半的非肌层浸润型膀胱癌会转变为肌层浸润型膀胱癌，而肌层浸润型膀胱癌手术后的5年死亡率为33%～73%，这一类型的肿瘤也是泌尿系统肿瘤中最难治疗的一种。外科手术切除联合化学治疗仍然是目前膀胱癌治疗的主要方法，很多患者在治疗初期也能显示出明显的治疗效果，在实施根治性膀胱切除术后，能有高达50%的患者得到治愈，但是他们依然存在着很高的癌转移风险，膀胱癌的远期复发率依然较高。由此可见，为更好地治疗膀胱癌，我们需要建立针对膀胱癌的更有效的临床模型以推动膀胱癌治疗药物及其他新型治疗方法的研发，而构建膀胱癌类器官模型便是一种有效的方式。类器官模型以其独特的优势，目前已在膀胱癌研究领域获得了广泛的应用。
由于肿瘤细胞的各种细胞活动均受到微环境的深刻影响，其遗传特征与基因表达也与其所处的微环境息息相关，当肿瘤细胞脱离了特定的肿瘤微环境，其各种特征均可能会与原代细胞产生较大差异。研究表明，在体外模型中，与单细胞以及2D细胞培养相比，3D肿瘤类器官模型与体内肿瘤遗传特征最为接近。Dangles等人［8］以膀胱癌患者手术切除组织为样本，培养获得了患者来源的肿瘤细胞系与肿瘤类器官，研究了单细胞、2D单层细胞与类器官中多种肿瘤关键基因的表达情况，对比了3种模型间的差异。研究发现，体外模型中肿瘤细胞的基因表达谱有显著变化，针对28个关键基因的实时荧光定量PCR结果显示，同一患者来源的不同体外培养模型的细胞在MYC、CGB等关键基因的表达上可能存在很大差异，差异水平在几倍到几十倍不等。虽然3种体外模型的肿瘤基因表达均与原代在体肿瘤存在差异，但该研究也指出，对于肿瘤中有限基因集的研究而言，类器官与其他两种模型相比依然是最合适的体外模型。同时类器官的组织切片显示，类器官的组织结构与侵染性癌症患者腹水中的肿瘤细胞聚集体结构类似，进一步证明了类器官模型在模拟体内肿瘤上的优势。
由于类器官能够更好地模拟原位肿瘤，故可以运用类器官模型研究肿瘤发生发展中的重要分子、信号通路等，也可以通过检测肿瘤来源类器官表达的各类蛋白标志物，鉴定肿瘤的侵染性、黏附性、活动性等特征，甚至能够通过类器官研究发现新的蛋白标志物。Takahiro Yoshida等［9］即运用类器官研究了在泌尿道上皮损伤后修复以及膀胱癌中发挥重要作用的Wnt/β-连环蛋白通路。研究显示，膀胱癌类器官的生长离不开β-连环蛋白的存在，同时Wnt/β-连环蛋白通路激活剂CHIR在膀胱癌细胞系类器官以及人原代肿瘤细胞类器官中能够促进肿瘤增殖，然而在贴壁细胞中该激活剂却会抑制细胞的增殖。这一结果也提示了运用不同研究模型可能得到完全不同的结果，故在肿瘤研究中要谨慎选择研究模型。Catherine Booth等［10］则运用类器官研究了细胞黏合素C在正常膀胱组织与膀胱癌中的表达，发现了TGF-β1、IL-4等重要因子对膀胱泌尿上皮细胞细胞黏合素C表达的诱导作用，并提出细胞黏合素C的免疫反应性或许能够为评估膀胱癌早期间质浸润提供新的思路。
2.膀胱肿瘤微环境研究
肿瘤微环境主要由肿瘤细胞及其周围的免疫细胞、肿瘤相关的成纤维细胞、附近的间质组织、血管组织以及各种细胞因子和趋化因子等构成，是一个复杂的综合系统。微环境中的不同类型细胞和微环境的理化性质如p H、氧含量等均会对肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等产生重要影响。运用膀胱类器官模型能够研究肿瘤微环境的多种成分、性质等对肿瘤的影响。
Pawel Swietach等［11］用膀胱癌细胞构建的类器官作为模型，研究了碳酸酐酶CA9对肿瘤组织内p H分布的影响。CA9在多种肿瘤中高表达，特别是在侵袭性强的肿瘤，其能够促进CO 2在细胞外区域内的扩散。当肿瘤类器官细胞异源性表达CA9时，类器官结构中的所有细胞呈现出几乎一致的胞内p H，而当无CA9表达时，类器官中则会出现酸性核区域，并呈现不均匀的胞内p H分布。因而研究者提示，抑制CA9活性能够影响肿瘤p H的空间分布，可能成为CA9相关肿瘤的新的治疗策略。Dong Hui Shin等［12］则运用转移性的以及与之对应的非转移性的膀胱癌细胞系构建的肿瘤类器官研究了微环境中低氧与基质金属蛋白酶以及肿瘤细胞的生长迁移的关系，证明了活性氧在缺氧介导的基质金属蛋白酶1的表达中起着重要作用，同时在肿瘤细胞转移过程中出现了胞内氧化还原环境的升高，能使肿瘤细胞更倾向于增强缺氧反应。这一研究进一步证实了恶性肿瘤中活性氧和缺氧之间存在着重要的相互作用，转移性肿瘤细胞能够利用细胞内活性氧的增加来驱动促肿瘤转移信号的产生。
微环境中的其他细胞与肿瘤细胞的相互作用往往会对肿瘤细胞产生较大影响，如肿瘤相关的巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）与成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）被认为有促瘤功能并与癌症较差的预后相关。Makito Miyake等［13］通过类器官研究了人膀胱肿瘤微环境中TAM与CAF诱导的旁分泌情况。3D培养的膀胱癌细胞与TAM/CAF的共培养实验表明，TAM/CAF分泌的CXCL1在肿瘤细胞与基质细胞的细胞间黏附与相互作用中发挥着重要作用，表达CXCL1的TAM/CAF能够促进肿瘤细胞与TAM/CAF形成更强的黏附，促进肿瘤细胞生成更大的肿瘤球。肿瘤类器官除了能够用于研究肿瘤微环境对肿瘤细胞生长的影响，也能够用于研究肿瘤微环境对其他类型细胞的影响。Eva Gottfried等［14］将膀胱癌等细胞系形成的类器官与单核细胞共培养，研究了各种肿瘤衍生因子包括细胞因子（如IL-6和M-CSF）、肿瘤代谢产物（如乳酸）对肿瘤浸润单核细胞表型的影响。结果显示，肿瘤组织中的高乳酸浓度可以单独或与其他细胞因子联合诱导形成肿瘤特异性的树突状细胞。由此可见，相比于2D平面培养的肿瘤细胞，肿瘤类器官在微环境的研究中有着独特的优势。
3.膀胱肿瘤干细胞研究
肿瘤中存在着肿瘤干细胞这一特殊的细胞亚群，肿瘤干细胞被认为具有干细胞样特征，可以进行自我更新与增殖，其数量虽然很少，却能够决定肿瘤的侵袭性、转移性、异质性与治疗抗性，因此根除肿瘤干细胞可能成为肿瘤治疗的有效方法。已有研究表明，肿瘤干细胞能够在体外培养条件下增殖形成球状结构，因而类器官也成为肿瘤干细胞体外增殖与和研究的有效模型。移行细胞癌是膀胱癌的一种常见类型，Angela Bentivegna等［15］从人原代移行细胞癌中分离细胞并对其进行培养，通过对培养得到的类器官的克隆起源、自我更新和长期增殖能力等方面研究，进一步证明了在膀胱移行细胞癌中的确存在表现出干细胞特征的肿瘤细胞，这些肿瘤干细胞存在CD133、Oct-3/4等干细胞标志物的表达。而在针对膀胱癌细胞转移能力的研究中，Kaijie Wu等［16］以高转移性的T24-L细胞为基础，构建了相应的类器官，发现在类器官培养中silibinin处理能够显著抑制肿瘤球的生长。此外，进一步的研究表明，silibinin处理肿瘤细胞能够抑制肿瘤干细胞，即降低了干细胞标志物的表达与并抑制肿瘤细胞的上皮间充质转化，从而抑制肿瘤的转移。这一过程与silibinin抑制GSK3β/β-连环蛋白通路以及下游的ZEB1表达有关。
4.膀胱肿瘤治疗
由于肿瘤类器官能够保留患者特异的组织病理学特征与分子层面的多样性，其在癌症精准治疗上有着广泛的应用前景。膀胱癌患者确诊时往往处于疾病进展早期，非肌肉浸润性膀胱癌患者通常需要接受多次肿瘤切除及其他治疗遏制肿瘤进展，尽量避免实施全膀胱切除术以保证患者的生活质量。因此，以个性化培养的类器官为模型，筛选出针对特定患者有效的候选药物的方法，能够在一定程度上指导膀胱癌的治疗。同时，这种方法能够较好地避免药物治疗带来的副作用，提高早期治疗的成功率与患者的依从性。患者来源的肿瘤类器官正在逐渐成为个性化治疗中高通量药物筛选的有效体外模型。(https://www.daowen.com)
Lucas Becker等［17］构建了一个无标签的成像系统，利用拉曼微光谱（RMS）和荧光寿命成像显微镜（FLIM）在膀胱癌细胞系、患者来源原代肿瘤组织以及患者尿液来源细胞构建的膀胱癌类器官中通过原位细胞分析和代谢监测评估了不同药物的治疗效果。研究者使用不同浓度的膀胱癌药物，如顺铂、维列托克处理膀胱癌类器官，通过RMS监测药物治疗后的类器官响应，即通过多变量数据分析比较施用或未施用药物的膀胱癌类器官的拉曼光谱，基于特异性分子振动的位移和强度的变化监测药物对肿瘤细胞核、线粒体等亚细胞结构的影响，同时通过NADH和FAD局部自体荧光团的评估分析不同药物对肿瘤细胞代谢的影响。该方法实现了对肿瘤-药物相互作用的无创的、分子水平敏感性的监测，有助于优化膀胱癌患者的治疗。Suk Hyung Lee等［18］则利用膀胱癌患者组织活检得到的组织样品，构建了来自16个患者的膀胱癌类器官生物样本库。研究者对这些不同来源的类器官系进行了癌症类型的鉴定，并以这一生物样本库为基础开展了药物响应实验。实验在十几个类器官系中检测了几十种化合物的施用效果，揭示了不同类器官系对药物的响应既存在着一定的相似性也有着很大的不同，而这些相似或不同在一定程度上与其细胞突变特征相关。如部分类器官对ERK和MEK抑制剂展现出很好的药物响应，这些类器官恰好存在FGFR3的活化突变，而ERK和MEK正是FGFR这一与多种肿瘤密切相关通路的下游信号分子。研究者还在异种移植模型中验证了药物筛选的结果，结果显示在多个类器官模型中筛选得到的药物组合也能够在对应的异种移植模型中产生效果，进一步展现了类器官在癌症药物筛选中的巨大潜力。
除了药物治疗，放疗也是膀胱癌常见的治疗手段，放疗能够避免实施大手术，并能尽量避免全膀胱切除，保留患者的膀胱，提高患者生活质量。但与膀胱癌根治性手术一样，放疗疗法总体生存率较低，且可施加的辐射剂量非常受限，因为过高的辐射剂量会对正常组织产生损伤，带来严重的副作用。而靶向肿瘤的特异性放射治疗，使用放射性核素与肿瘤靶向药物相结合，能够在保留正常组织的情况下对肿瘤细胞进行选择性辐射。这种治疗将大大降低辐射对邻近组织的损伤，特异性增强对肿瘤细胞的辐射，降低癌症复发率，具有替代传统放疗的潜力。［131 I］间碘苄基胍（［131 I］-MIBG）即为一种肿瘤靶向放射性药物，膜结合去甲肾上腺素转运蛋白（noradrenaline transporter，NAT）能够促进［131 I］-MIBG的细胞摄入。类器官模型在这种靶向放疗药物的研制中也能发挥重要作用，Natasha E.Fullerton等［19］即以膀胱癌类器官为研究模型，充分利用NAT这一功能，在无内源表达NAT膀胱癌类器官中用肿瘤特异性的启动子使肿瘤细胞产生NAT的外源特异性表达，显著提高了肿瘤细胞对［131 I］-MIBG的摄入，提高了肿瘤细胞的杀伤效果，证明了［131 I］-MIBG在治疗膀胱癌中也存在应用潜力。
膀胱类器官不仅可以辅助传统抗肿瘤药物的个性化筛选，也能够用于免疫治疗的相关研究。Lei Yu等［20］以膀胱类器官为模型，在类器官与相应的患者肿瘤组织中对CAR可识别的抗原进行检测，发现MUC1在二者中均有表达。因而研究者构建了能够特异性识别MUC1的CAR-T细胞，在类器官中检测该CAR-T细胞对肿瘤的特异性杀伤能力。结果显示，MUC1特异性CAR-T细胞能够在MUC1阳性类器官而不是MUC1阴性类器官中表现出细胞毒性。这一研究建立了一个清晰的基于患者来源的膀胱癌类器官模型的个性化临床前CAR-T细胞检测的工作流程，也展现出膀胱癌类器官在改善膀胱癌和其他实体肿瘤的个性化免疫治疗上所能发挥的重大作用。
5.膀胱细菌感染
膀胱炎是一种常见的泌尿道感染性疾病，可大致分为急性无并发症膀胱炎与反复发作性膀胱炎。由于女性尿道较短且接近肛门，易遭细菌侵袭，因此女性膀胱炎发病率高于男性。膀胱炎也成为女性最常见的泌尿道感染疾病，且超过80%由大肠杆菌感染导致［21］。急性膀胱炎会引起尿频、尿痛、下腹部疼痛等症状，为患者生活带来很大不便。同时膀胱炎中的细菌感染可扩散至血液、肾脏等其他组织或器官，引起相关并发症，进而导致病情的恶化。
目前常用小鼠模型研究膀胱细菌感染，然而小鼠模型存在一定的局限性难以在原位表征不同细菌亚群，包括胞外细菌、胞内细菌以及胞内静默菌群的细菌数量、生长动态以及它们在抗生素或免疫细胞作用下的存活情况。而膀胱类器官在研究膀胱细菌感染上展现出了独特的优势。膀胱类器官拥有与膀胱高度类似的多层分化上皮结构与中央腔体结构，能够较好地模拟膀胱的组织结构，同时，类器官的体积能够使用高分辨率的显微镜准确测定，有利于跟踪感染后组织动态的快速变化，监测宿主细胞和细菌对抗生素治疗、免疫细胞等扰动因素的响应。Kunal Sharma等［22］运用小鼠来源的膀胱类器官对尿道致病性大肠杆菌进行研究，指出类器官模型能够较好地解决其他研究模型所存在的问题，如可以较方便地检测细菌在类器官膀胱壁中的生长、能够便捷地添加或移除抗生素、观测感染后免疫细胞的迁移与响应等。运用类器官的研究进一步证实了尽管膀胱类器官腔是细菌增殖的主要场所，但在类器官壁内同样存在一群细菌，这些细菌能够产生抗药性，使得膀胱感染对抗生素及中性粒细胞的杀伤产生一定的抵抗力。
6.膀胱组织发育和再生
膀胱功能障碍是一类较为常见的膀胱疾病，是所有尿液储存和排尿障碍的统称，包括压力性尿失禁、膀胱逼尿肌收缩力低下症、膀胱过度活动症、间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征等。目前治疗膀胱功能障碍有多种方法，例如针对尿失禁有行为学疗法、药物治疗、外科手术治疗等。外科手术治疗有注射尿道膨胀剂、植入人工尿道括约肌等方法。虽然这些疗法均能产生一定的治疗效果，但是也均存在一定的局限性。如植入人工尿道括约肌能够很好地治疗男性重症尿失禁，但是这种人造装置使用寿命有限，同时存在感染风险，随着使用时间的延长还可能产生尿道糜烂、萎缩等症状。因而，以干细胞为基础的相关疗法越来越多地进入人们的视野，利用干细胞重构尿道括约肌或膀胱的其他组织结构可能会更好地治疗多种膀胱功能障碍。运用干细胞构建的组织类器官也可以进行药物筛选等临床前研究，为临床治疗提供思路与指导。另外，很多膀胱癌晚期患者会进行全膀胱摘除手术，而膀胱的摘除会给患者带来诸多不便，运用类器官技术则能够在一定程度上辅助膀胱组织的重构，改善患者的术后生活。
目前，类器官技术在治疗膀胱功能障碍、膀胱组织发育过程、感染损伤修复过程、膀胱组织再生等研究领域也能发挥着较大的作用。已有以类器官与体内模型为基础的泌尿道感染模型显示，存在少量有强大扩增能力的膀胱基质上皮细胞，能够在细菌感染损伤后通过寡克隆增殖重构膀胱上皮组织［23］。同时，干细胞或祖细胞分化形成类器官的再生治疗相关研究表明，器官功能可以通过整合体外转基因组织单元来恢复，而非必须通过全器官移植实现，为膀胱组织工程提供了更多思路。
7.膀胱类器官的局限性与新型技术发展
虽然类器官在很多生物学领域均有着广泛的应用，其依然存在诸多局限性。首先，很多类器官缺乏体内系统中包含的丰富的细胞成分（如基质细胞、血管内皮细胞以及各种免疫细胞）。如前所述，肿瘤细胞的生物学和行为会受到微环境因素的深刻影响，如在2D或3D培养中生长的同来源的肿瘤细胞，在单独培养或与成纤维细胞共培养后药物敏感性存在很大差异［24］。除了难以模拟体内真实微环境的问题，某些情况下类器官的培养成功率也有待提高，从转移性组织活检中培养构建类器官系的效率仅为15%～20%，而肿瘤相关梭形细胞的过度生长则是导致类器官培养失败的最常见原因［25］。目前研究者也在积极探索试图解决这些技术问题，如对类器官培养基进行改良、纯化癌症样本、去除肿瘤中的良性细胞和基质细胞、减少组织处理时间等。除此之外，在传统类器官培养技术的基础上也有新技术、新方法被不断开发出来。
针对目前很多类器官的构建缺乏体内的微环境，特别是免疫微环境的问题，Zhiyi Gong等［26］提出了新的类器官构建方法，能够较好地保留膀胱癌肿瘤的免疫微环境。该技术以表面声波产生的轻柔声波力喷出细胞，能够在一天内快速构建肿瘤球，并在一周之内培养形成肿瘤类器官。与其他传统喷墨打印类器官的方法相比，该方法得到的细胞活性更高，且更适合于原代细胞的培养。同时，该方法生成的类器官能够在两周内保持与原代肿瘤类似的复杂的免疫微环境。目前研究者已使用该方法成功构建了膀胱癌肿瘤在内的多种肿瘤类器官，其克服了目前大部分类器官构建方法无法真实模拟原代肿瘤免疫微环境的问题。同时，该方法构建的类器官能够与同源的免疫细胞共培养，两天内即可以发生杀伤性T细胞的增殖与对肿瘤细胞的杀伤。由此可见，该类器官构建方法可用于快速构建含有患者独特免疫微环境的体外模型，这样的体外模型适用于研究患者对临床各种免疫疗法的响应，能够缩短实验周期，较好地辅助临床治疗。
目前类器官大多结构相对简单，无法形成成熟器官的复杂结构，为解决这一问题，Eunjee Kim等［23］发明了膀胱“类组装体”的构建方法。这种膀胱类组装体是与类器官类似的有3D结构的体外培养模型，其由正常膀胱干细胞或患者的膀胱肿瘤细胞构成，然而与类器官相比包含了更丰富的基质细胞组织成分，并更完整地构建了微环境结构。类组装体的基质细胞成分主要包括基质成纤维细胞（在肿瘤模型中即为肿瘤相关的成纤维细胞）、上皮细胞、免疫细胞与肌肉层细胞。研究者首先构建了长期培养的膀胱类器官，然而发现此种类器官缺乏正常膀胱组织的多种关键成分，如基质细胞，因而进一步使用培养时长为200天的膀胱类器官与鼠胚胎成纤维细胞、人肺微血管内皮细胞、肌肉层细胞构建“类组装体”，成功形成了由平滑肌细胞与上皮细胞构成的组织结构。该组织结构由外层肌肉层包裹连接性基质细胞层和多层泌尿道上皮细胞组成。同时，使用类似的方法构建了人的膀胱类组装体，构建形成的类组装体从组织染色结果上看包括三层组织结构，结构较为清晰完整，类组装体对基质Hedgehog通路的响应也与成人体内膀胱组织相似。单细胞测序结果也显示，类组装体培养一定时间后其细胞组成与正常膀胱组织相近，其相似程度可高达90%。此外，研究者还以膀胱癌类组装体为模型，研究了FOXA1-BMP-Hedgehog轴在肿瘤可塑性中的作用，提出了增强子重编程能够在表观遗传层面影响肿瘤亚型可塑性的相关机制。由此可见，结构更为完整复杂的“类组装体”可能为类器官的研究提供了新的方法与思路。