9.4.3 研究乳腺复杂基质微环境相互作用
乳腺微环境是由ECM和几种不同细胞类型（包括成纤维细胞、脂肪细胞、免疫细胞和血管内皮细胞等）组成的复杂组织环境［3］。乳腺微环境足以启动和维持正常的乳腺细胞命运，它们共同形成了乳腺正常发育和功能所需的复杂相互作用网络。
ECM可以影响类器官的生长，但来自不同上皮组织ECM的蛋白质特征有很大差异。从成年小鼠和大鼠中分离的乳腺细胞外基质（mammary extracellular matrix，m ECM）能够指导睾丸来源细胞（testicular-derived cell）和胚胎干细胞（ESC）向乳腺组织细胞进行定向分化，最终在剥离上皮的小鼠乳腺脂肪垫上形成功能性乳腺上皮细胞［57］。而从视网膜脂肪组织和肺组织中分离的ECM不能将睾丸来源细胞定向分化到乳腺上皮细胞，这表明乳腺组织特异性ECM能够驱动干细胞分化，进而在体内形成功能性乳腺组织［57］。
为了研究乳腺细胞和ECM的空间分布对乳腺发育的影响，研究者开发了3D生物打印乳腺类器官培养方案。Peter A.Mollica等将由大鼠或人类乳房组织ECM制备的水凝胶与3D生物打印平台相结合，ECM水凝胶保留了乳腺独特的结构和信号传导特征，能够保证类器官在乳腺组织特异性基质中生长［13］。商品化的Matrigel通常是减生长因子的，而mECM能够保留乳腺特异性的生长因子水平，其生长因子（EGF、FGF7、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、TGF-β和VEGF等）含量显著高于减生长因子Matrigel，这可能是m ECM能够驱动细胞向乳腺组织定向分化的重要原因［13］。m ECM联合3D生物打印技术，为乳腺发育和癌变研究提供了良好的研究平台。(https://www.daowen.com)
成纤维细胞在乳腺微环境中发挥核心作用。Zuzana Koledova等人构建了乳腺类器官-成纤维细胞共培养模型，发现成纤维细胞可促进乳腺分支形态发生，提示成纤维细胞在乳腺发育中发挥核心作用［58］。研究发现，FGF2通过调节肌动蛋白诱导成纤维细胞迁移，并促进乳腺成纤维细胞产生ECM蛋白（包括胶原蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白和基质金属蛋白酶等）［59］。将乳腺类器官与成纤维细胞进行3D共培养时，成纤维细胞分泌的FGF2和FGF9通过旁分泌信号调控乳腺基质重塑，诱导乳腺上皮细胞分化发育［59］。敲低SPRY1能够激活成纤维细胞EGFR信号通路，通过增强其旁分泌信号和ECM重塑，调控乳腺上皮形态发生［60］。成纤维细胞可促进乳腺导管腺泡发育，进一步研究乳腺类器官-成纤维细胞共培养模型有助于了解成纤维细胞在调节乳腺上皮形态发生中的作用。
血管内皮细胞是骨髓、脑、肝和乳腺等器官发生和干细胞维持的重要调节因子。研究者利用内皮细胞和乳腺上皮细胞共培养模型，发现内皮细胞是乳腺组织重塑的重要参与者，这种共培养体系为研究内皮细胞调节乳腺类器官形态发生和癌前病变提供了良好的研究模型［61］。内皮细胞与MCF10AT1-EIII8（癌前病变细胞系）共培养时，能够促进MCF10AT1-EIII8细胞产生分支导管和乳腺腺泡，这对于产生功能性血管网络和具有侵袭潜力的增殖性导管乳腺组织至关重要；雌激素通过诱导血管内皮生长因子及其受体表达，加速了血管内皮增生、MCF10AT1-EIII8细胞向恶性表型转化［61］。内皮细胞除了有将营养物质和氧气输送到组织方面的作用外，也为正常和恶性乳腺上皮提供增殖信号，在体外共培养时也能够促进乳腺导管上皮形成具有导管和腺泡的导管样结构［62］。Jingqiang Wang等人将乳腺上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞共培养，这种共培养模型诱导了长而明显的乳腺导管分支，更好地再现了体内乳腺的组织结构［63］。此外，研究者发现血管内皮细胞激活了成纤维细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，从而促进了乳腺导管分支发育，表明血管内皮在组织形成过程中的重要性，揭示了乳腺微环境中不同细胞协同调节乳腺器官发生和组织稳态维持的相互作用机制［63］。
乳腺处于大量脂肪细胞浸润的独特微环境中。在青春期，乳腺双层上皮逐渐嵌入胶原/脂肪细胞基质内产生导管网络；此外，脂肪细胞也是乳腺癌微环境中最主要的非恶性细胞类型。Jonathan J.Campbell等人建立了脂肪细胞（3T3-L1）和永生小鼠乳腺上皮细胞（KIM-2）3D共培养模型，成功培养了能够响应泌乳激素刺激的功能性乳腺类器官［64］。在胶原蛋白/透明质酸支架中，KIM-2细胞与脂肪细胞共培养3周后形成了末端圆钝导管分支结构，与体内乳腺组织导管或腺泡形态相似［64］。KIM-2类器官显示出正确的上皮极性，水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）和ZO-1紧密连接排列在腔内，integrinβ1、Ⅳ型胶原（collageⅣ）和层粘连蛋白（laminin）定位于外层基底细胞。更重要的是，KIM-2类器官中的管腔上皮细胞能够影响泌乳素刺激，分泌β-酪蛋白（βcasein）［64］。在小鼠乳腺癌模型中，肥胖小鼠的肿瘤体积明显大于正常小鼠，而且高脂饮食明显加快小鼠肿瘤进展［65］。脂肪酰基辅酶A合成酶（Acsbg1）是肥胖依赖性肿瘤生长的驱动因素，高脂饮食促进小鼠乳腺癌细胞Acsbg1表达上调，从而促进了肌酸依赖性肿瘤的进展［65］。肿瘤周围脂肪细胞共培养的乳腺癌细胞显示出对铁死亡的抵抗，进一步实验发现，脂肪细胞可以通过分泌特定的脂肪酸诱导乳腺癌细胞产生铁死亡抵抗，并且该过程依赖于脂肪酸合成酶（Acsl3）［66］。