9.4.5 乳腺疾病模型
1.乳腺普通型导管增生
普通型导管增生（usual ductal hyperplasia，UDH）是乳腺最常见的良性病变，通常不需要干预。但月经期间激素水平变化可引起乳房疼痛，严重影响了患者的生活质量。非癌性乳腺细胞系HMT-3522 S1在没有Matrigel的培养基中能够自发形成细胞球（球状体），具有UDH的许多病理特征［14］。这些细胞球经历了一个复杂的成熟过程：最初均匀的细胞球表面形成实体细胞索并产生基底膜，然后分化产生表达基底细胞（CK14）和管腔上皮细胞（CK8）标志物的不对称管腔［14］。HMT-3522 S1细胞球模型为研究UDH提供了良好的模型，可以帮助探索人乳腺UDH组织中新月形不对称管腔形成的分子机制。
2.乳腺炎
乳腺炎是另一种常见的乳腺良性病变，部分患者是细菌感染后发病，哺乳期乳腺炎患者可检出金黄色葡萄球菌，而非哺乳期乳腺炎多为Kroppenstetii棒状杆菌［3］。类器官代表了特定器官的所有细胞成分，因此理论上也适合病原体致病的研究，特别是依赖人体特殊细胞类型的微生物。目前尚未在类器官模型上探索细菌在乳腺炎中的致病机制。由于类器官体外培养方便操作，研究人员已建立了多种病毒感染的类器官模型，如寨卡病毒和单纯疱疹病毒感染脑类器官用于探究小儿畸形的发病机制［68］。SARS-Co V-2病毒将病原体感染类器官模型的运用推向高潮。而西湖大学蔡尚教授团队将细菌和乳腺癌细胞在Matrigel中悬浮培养生成类器官，并在类器官的胞质中观察到单个或成簇的细菌，构建了细菌-乳腺肿瘤类器官模型［69］。这些技术将为包括乳腺炎在内的感染性疾病的研究提供支持和新思路。
3.肿瘤发生
2016年，Serena Nik-Zainal等对560例乳腺癌样本进行全基因组测序，前10种突变基因分别是TP53、PIK3CA、C-MYC、CCND1、PTEN、ERBB2、ZNF703/FGFR1、GATA3、RB1和MAP3K1［70］。此外，乳腺癌的发生与DNA损伤修复有关，BRCA1或BRCA2缺陷是最重要的两种与损伤修复相关的基因突变［71］。
除了年龄和一些遗传因素外（例如BRCA1/2），乳腺密度与乳腺癌风险的关联强度大于大多数其他已确定的乳腺癌危险因素［72，73］。乳腺密度是纤维结缔组织和腺体组织含量与脂肪组织含量的相对比例，与乳房密度较低的女性相比，乳房致密的女性患乳腺癌的风险高出4～6倍［72，73］。来自致密性乳腺组织的上皮细胞中出现DNA损伤信号增强（γH2AX表达上调）、端粒缩短和激活素A（activin A）分泌增加，这些改变与乳腺癌患病风险相关［74］。在乳腺类器官研究中，可以通过增加与组织硬度增加相关的胶原蛋白含量来模拟致密性乳腺结构。184A1可以在体外Matrigel培养中形成乳腺腺泡结构，高硬度Matrigel能够增加乳腺类器官的异常管腔形成；如果配合低剂量辐射，异常管腔形成的比例将进一步增加［72］。而管腔结构异常表明乳腺类器官丢失其正确极性，提示乳腺类器官可能发生了不典型增生或癌变。(https://www.daowen.com)
类器官联合CRISPR-Cas9基因编辑技术进一步加深了人们对乳腺癌变机制的认识。Johanna F.Dekkers等利用CRISPR-Cas9靶向敲低4种乳腺癌肿瘤抑制基因（P53、PTEN、RB1和NF1），突变后的类器官能够长期在体外培养［75］。将突变后的类器官移植到小鼠体内后，1株（1/6）P53/PTEN/RB1突变系和3株（3/6）P53/PTEN/RB1/NF1突变系形成了雌激素受体阳性的肿瘤，并且这些类器官对内分泌治疗或化疗敏感［75］。Zheng Zhang等人基于乳腺类器官模型，运用RNAi和CRISPR-Cas9技术，降低了Ptpn22和MII3基因的表达，加速了PI3K驱动的肿瘤增长［18］。
女性在70岁前BRCA1/BRCA2杂合子患乳腺癌的累积风险分别为55%～65%和45%［71］，但目前BRCA1/2突变导致乳腺组织癌变的机制尚不完全明确，少数研究也在类器官模型上进行了进一步探讨。BRCA1乳腺类器官中乳腺干细胞标志物醛脱氢酶-1（aldehyde dehydrogenase-1，ALDH1）蛋白水平升高，表明BRCA1参与乳腺干细胞的更新和分化；选择性PR调节剂醋酸特拉普司酮（TPA）能够显著降低BRCA1乳腺类器官ECM相关基因（MMP1、MMP10、COL1A1、COL3A1、A2M和FN1）的表达，提示BRCA1突变影响人正常乳腺类器官中的黄体酮反应［76］。Nur Yucer等人发现BRCA1基因突变输卵管类器官表现出组织结构异常，出现细胞拥挤、极性丧失和细胞核的严重异型性；进一步研究表明BRCA1基因突变输卵管类器官具有肿瘤转化潜力和癌变特征，能够在体外模拟早期卵巢癌恶性转化过程［77］。这些技术将为遗传性乳腺癌的研究提供支持和新思路。
CRISPR-Cas9、慢病毒载体、电穿孔和脂质体转染等方法已成功用于改造乳腺类器官基因表达。类器官模型一定程度上解决了患者间肿瘤差异所致的研究难题，然而同一肿瘤在不同时间段和不同部位仍存在差异，即肿瘤的时间和空间异质性。Sophie F.Roerink等将3个结直肠癌标本切割成4～6片区域，每片单独制备为类器官，单细胞测序发现每片区域在表观基因组、转录组、蛋白组和代谢状态都存在差异［78］。因此，利用基因编辑技术深入了解乳腺癌发生的关键驱动因素时，需要更多的研究来提高基因编辑效率，增加目标特异性，并减少潜在的脱靶现象，以期为乳腺肿瘤防治提供更加理想的研究模型。
4.肿瘤侵袭转移
EMT是肿瘤转移的重要机制，特征性标志是E-钙黏蛋白表达降低和波形蛋白增加。小鼠转移性乳腺癌细胞D2.A1衍生的类器官多呈球形，E-钙黏蛋白完全缺失，而休眠期D2.OR细胞诱导分化形成的类器官可产生分支结构，并表达大量E-钙黏蛋白［79］。Sabra I.Djomehri等人用TGF-β1和缺氧处理MCF10A类器官后出现EMT表型［80］。酸性肿瘤微环境同样可影响肿瘤的生物学行为［81］。Na HCO 3治疗可使乳腺上皮类器官p H提高0.15，同时提高类器官的增殖活性；这可能因为Na HCO 3中和了乳腺癌的酸性环境，提高了细胞排酸能力并加速了细胞增殖［81］。敲低11种不同的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）显著减少了乳腺肿瘤细胞的增殖、侵袭和（或）集体细胞迁移；这些与正常乳腺上皮相比过表达的lnc RNA，能够有效增加乳腺癌类器官分支产生，即增加其侵袭转移能力，但不会影响正常乳腺类器官分支发育，这意味着这11种lncRNA在乳腺肿瘤细胞侵袭转移具有癌症特异性作用［82］。Gayatri Arun等发现Malat1 lncRNA的缺少会导致细胞黏附增加和迁移能力降低，在Luminal B型和HER-2过表达型的乳腺癌类器官中表现为导管分支形态发生减少［83］。具有EMT转化特征的MDA-MB-231类器官形成伴有突起的多细胞球体，而无EMT转化特征的乳腺类器官中多形成腺泡；暴露于TGF-β后，MDA-MB-231类器官突起明显增多，形态不规则；其中，PIAS1可通过调控转录调节因子Sno N苏木化（sumoylation）修饰抑制MDAMB-231类器官的侵袭行为［84］。
细胞系、类器官与侵袭性肿瘤组织基因表达分析发现了1 017个独立于病理亚型和模型的差异基因，其中947个与免疫相关［85］。这也说明类器官在侵袭转移研究中需要解决与免疫细胞、脂肪细胞和血管上皮细胞等多种细胞共培养的问题。Sabra I.Djomehri等人发现与MCF10A类器官相比，间充质干细胞和MCF10A共培养类器官中细胞连接减少，同时MCF10A细胞呈纺锤体状，出现纤维样表型（Col1＋）、CK5/6表达中断且无腺泡形成［80］。器官芯片和微流控通道等技术可使多个器官、细胞连接成一个整体，使类器官更好地模拟肿瘤-微环境的相互作用，将进一步激发类器官的运用潜力。