CO2培养箱(至少3台)
培养箱是辅助生殖实验室最为关键的仪器之一,是配子孵育、胚胎发育、试剂平衡的主要场所,是维持配子或胚胎适宜且稳定的酸碱度、温度及相对湿度的体外生长环境的基础。实验室内需根据不同用途配置不同的培养箱,不同用途的培养箱也需要也根据实际情况配备可作为备份的相同类型培养箱,在此基础上根据实验室周期数的增加应适时增加培养箱来满足更多周期同时运行的要求。
1.CO2培养箱(20%O2高氧培养箱):
实验室中高氧培养箱一般可用于试剂的预平衡、精子孵育上游、精子存活实验、培养液的质控等,也可为不需要CO2预平衡的试剂提供适宜的温度环境,对试剂进行提前预热,如图3.33及图3.34所示。
图3.33 用于试剂预平衡的CO2培养箱
图3.34 用于精子处理的CO2培养箱
用于试剂预平衡的培养箱应根据试剂说明书确定预平衡所需的CO2浓度,一般设定为5%或6%的状态。当对无须CO2平衡的试剂进行复温时应使放入培养箱的试剂处于密封状态,避免与高浓度CO2接触,温度设定为37℃。
2.三气培养箱(5%O2低氧培养箱):
因为人体内输卵管内环境即为2%～8%氧浓度的低氧环境,而且高O2环境在代谢过程中更易产生自由基或游离基,对细胞生长有副作用,因此人类胚胎生长应该更合适在低氧的环境下进行。使用三气培养箱即可满足胚胎发育的低氧环境,因此将三气培养箱作为胚胎培养的主要场所,如图3.35所示。
图3.35 用于胚胎培养的三气低氧培养箱
为营造低氧环境,三气培养箱应接入N2及CO2两种气体,培养箱设定为CO2 6%(部分品牌培养液可能需要不同的培养条件),O2 5%;温度设定为37℃。每个培养箱内培养的患者数根据培养箱大小确定,正在使用时应在培养箱外部进行明显的标记。
3.桌面培养箱(混合气培养箱):
桌面式培养箱采取干燥环境,要求使用预混合气体,其具有占地面积小、移动方便、加热温度均匀、温度介质距离近等优点,相比传统的培养箱,桌面培养箱可以更快地恢复到稳定的状态,可使培养皿等迅速处于工作温度和气体条件,如图3.36所示。
图3.36 用于胚胎培养的桌面培养箱
桌面培养箱不仅可以用于日常胚胎培养,而且因其占用空间较小,可以放入IVF工作站内缩短培养液或配子胚胎的运输距离,完成临时的特殊操作,届时应根据需要决定是否通气,调整培养舱内的气体环境。如放入捡卵工作站时临时存放捡出的卵母细胞可保证卵母细胞,所处环境的温度恒定(图3.37),放入冷冻解冻工作台时保证冷冻解冻液迅速达到工作温度且避免在运输传递过程中的温度损失,确保操作的可靠性(图3.38)。
桌面培养箱所需通入的气体为预混合气体,具体配比为CO2 6%,O2 5%,N2 89%(体积比),正常使用待机状态下其气体流速约为30mL/min,盖温及底板温度均设定为37℃。
图3.37 用于捡卵操作的桌面培养箱
图3.38 用于冷冻解冻的桌面培养箱
4.时差培养箱:
与传统培养方式受精后16～19h(原核观察)、42h(观察2～4细胞期胚胎)、66h(观察6～8细胞期胚胎)、114h(观察囊胚)进行定点观察胚胎形态学参数不同,时差培养箱能提供从胚胎受精开始的连续动态分裂图像,从而为临床上胚胎的筛选提供更多参数。再者,日常工作中应用时差培养系统时,在应用全程培养液的条件下,不但可以避免胚胎在培养过程中反复进出培养箱而导致的应激状态、胚胎箱外操作引起的误操作等,而且还可以容许更宽泛的胚胎发育观察时间点,简化实验室工作人员的工作流程,提高胚胎实验室工作人员的工作效率,如图3.39所示。
图3.39 时差培养箱
时差培养箱各项参数均处于预设状态,培养箱初装时进行调校后方可正常使用,时差培养箱应接入N2及CO2两种气体。
5.培养箱的使用:
培养箱使用初期VOCs挥发量是旧培养箱的100倍以上,在使用前需进行一定时间的“空转”热处理,一般方法为37～40℃条件下正常运行15天以上,之后进行精子存活实验,精子在48h后活力≥70%、存活指数≥80%,确认精子存活实验通过,方可开始胚胎培养。培养箱日常使用方法及注意事项:
(1)培养箱设置温度为37℃,三气培养箱CO2设定浓度为6%,O2设定浓度为5%;CO2培养箱将CO2浓度设置为6%(或依据培养基的要求设置CO2浓度)。
(2)应适时检查培养箱气体在线过滤器有效期,通常情况下为6个月。过滤器更换后应标注更换日期和有效期,并完善《IVF实验室空气过滤耗材质控表》(表3.11)相关内容,使用后第五个月应提前订购相关耗材,以备及时更换;在过滤器有效期内如发生特殊情况(例如严重污染、浸湿、破损等),应及时更换过滤器。
表3.11 IVF实验室空气过滤耗材质控表
(3)开关培养箱门时应遵循以下原则:
①尽量避免多次开关门,确保培养箱内环境相对稳定。(https://www.daowen.com)
②每次开门/关门动作要轻,避免培养箱产生震荡。
③开门后应迅速进行相关操作,并及时关门,避免外界空气过多进入培养箱,同时避免样本长时间暴露。
④开关门后填写《培养箱开关门记录表》(表3.12),各项操作写“正”计数,每日对开关门总次数进行统计并记录在表格最后一栏。
表3.12 培养箱开门记录表
⑤每月对开门记录进行审核归档。
(4)不要放置没有必要的塑料制品在培养箱,它可能释放有害气体。
(5)及时检查培养箱内加湿水盆或加湿瓶内的水位,水位过低时应及时添加。
(6)禁止使用卤化物制剂清洁培养箱。
(7)每台培养箱安装远程报警及监控系统,并对其实时监控(图3.40、图3.41、图3.42)。
图3.40 培养箱气体检测仪
图3.41 培养箱温度监测仪
图3.42 培养箱实时监控手机APP界面
(8)将配子/胚胎放在培养箱的中间层或上层培养。
(9)对培养箱各项指标进行适当质量控制,及时填写质量控制表格,发现问题时及时处理,避免造成损失。
(10)培养箱的灭菌消毒与清洁:
①培养箱每半年进行一次全面灭菌。
②培养箱外部箱体及内部非金属部分使用专业灭菌液擦拭,金属部件送供应室统一灭菌。
③灭菌过后要对培养箱设定值及实际值进行调试和检测,数据无误后空转48h,之后再进行一次检测,数值正常且稳定后进行精子存活实验,精子在48h后活力≥70%、存活指数≥80%,确认精子存活实验通过,方可进行胚胎培养。
④佐证材料包括但不限于灭菌卡、精子存活实验记录、耗材出入库记录等。
⑤如果正常实验过程中出现样本污染的情况,应启动“培养箱污染应急预案”立即分析污染原因,如有需要,应对培养箱及周边环境进行全面灭菌。
⑥填写《IVF胚胎实验室培养箱灭菌记录表》(表3.13)并与相关佐证材料一同归档保存。
表3.13 IVF胚胎实验室培养箱灭菌记录表
(11)不同培养箱使用方式及相关技术流程可能略有不同,但大同小异,需根据具体情况对记录表格或流程进行微调。
(12)每季度或是每半年做一次分析,在排除患者和临床因素后,如果同一类型培养箱,同样条件下培养胚胎的结局存在差异,要考虑淘汰培养结局较差的培养箱。
6.培养箱的日常质控:培养箱一般设置温度为37℃,三气培养箱CO2设定浓度为6%,O2设定浓度5%;CO2培养箱将CO2浓度设置为6%。在培养箱日常使用过程中应对培养箱的运行状况进行质量控制,确保培养箱的安全运行,测量值失控时及时排查原因解决相关问题。
(1)每日记录显示数据和监控器数据,包括培养箱监控器显示温度、培养箱及监控器显示的CO2浓度,培养箱显示O2浓度;当显示温度或者气体浓度发生异常时,及时检测实际值,并寻找原因进行校准。
(2)每周一进行检测。气体浓度检测前不要开培养箱门,连接设备并关闭进气通道,检测结束后开门在中层放入温度计测量箱内温度,5min后记录实测温度,当检测值与显示值偏差较大(偏差温度＞0.2℃或者气体浓度偏差＞0.2%),应及时校准。
(3)每周打印电子监测记录并归档。
(4)进行培养箱每日开关门质控。
(5)根据实验室胚胎培养记录质控每个培养箱的胚胎培养效果。
(6)如实、及时根据各项质控原则填写《培养箱日常质控表》(表3.14)。
表3.14 培养箱日常质控表
