长受精检查标准化操作流程
长受精检查,主要目的是观察受精卵的原核情况进行原核评分。长受精检查分两种情况,第一种是已经进行过短受精观察的受精卵,另一种是未进行过短受精观察的受精卵,观察前需剥除卵母细胞外的颗粒细胞,进行过短受精观察的胚胎直接跳至步骤(二)。
1.剥卵操作流程:
(1)在37℃培养箱中预热可能需要使用透明质酸酶溶液、箱外操作液及矿物油。
(2)操作环境:百级净化工作台中操作,配备温度37℃加热板的体视镜和倒置显微镜下观察。
(3)用剥卵针剥离受精卵外层卵丘细胞,剥卵针内径约为135μm。
(4)了解患者过夜精子的情况:如未提示过夜精子培养液中可见较多密集的颗粒状物,可以开始进行;如提示过夜精子培养液中可见较多密集的颗粒状物,可能发生受精卵污染,需最后观察。
(5)物理吹打剥卵:需先使用剥卵针剥除外层卵丘细胞,用受精培养液润洗。体视镜下,用剥卵针在受精皿吹吐受精卵,剥离受精卵外层卵丘细胞。开始时,先剥离一个受精卵,如顺利,之后3～4个受精卵一起剥离。
(6)如物理方法剥离颗粒细胞效果欠佳,可进行酶消化处理剥除卵母细胞,具体操作方式如下:
①取出预热好的透明质酸酶及箱外操作液。
②制备剥卵皿:取100mm培养皿,制作150μL左右透明质酸酶微滴,在其下方制作若干50μL箱外操作液滴。
③盖5～6mL矿物油放置在37℃恒温工作台上备用。
④采用连续移液剥离周围卵丘细胞时,卵母细胞置于透明质酸酶溶液中不超过30s。
⑤立即采用最小体积的溶液(尽可能去除卵丘细胞)移除卵母细胞并转移至箱外操作液。采用移液管抽吸卵母细胞以移除剩余卵丘细胞和冠细胞。
⑥洗涤剥离的卵母细胞2次以上直至完全剥离。
2.转移胚胎进行原核检查:剥离颗粒细胞后,使用拉制的巴斯德吸管将卵母细胞转入备好的卵裂胚培养皿内。
(1)原核检查:在倒置显微镜下(400X)观察,观察内容及记录方式如下。
①原核数量:正常受精卵应具有清晰的两个原核(2PN)。只有一个原核为1PN,三个原核为3PN,未见原核或有三个以上原核等情况视为异常受精。对只有两个原核(2PN)的受精卵进行进一步观察,观察②～⑤的各项参数。(https://www.daowen.com)
②原核位置:相邻(L),分离(F)。
③原核大小:均一(E),不均一(U)。
④原核核仁:极化(P),分散(S),不同步(B)。
⑤最后评分根据Scott-Z评估法评定Z1-Z4级(图5.10)。
图5.10 Scott-Z评分图示
(2)核对无误后放入培养箱原位。作好受精情况记录,记录包括受精情况、观察时间、操作者、核对者。
(3)因受精卵剥离和观察是在培养箱外,此操作过程不能超过10min。
(4)一位患者受精观察结束后将所有用过的巴斯德吸管和剥卵针放入锐器盒,清理台面后方可开始下一患者的受精观察。
3.原核检查结果判读:
(1)对于常规受精失败或低受精率(2PN受精率＜20%)的患者视情况进行补救ICSI。
(2)常规受精失败或常规受精率低于20%的患者视卵母细胞成熟情况决定是否行补救ICSI,尽可能保证患者有一次胚胎移植机会。
(3)低受精率的患者:如果正常受精2PN≥2,受精卵形态正常,可以考虑不补救ICSI;如果正常受精2PN＜2,且有5个以上正常形态MII期卵母细胞,建议补救ICSI,经与主管医师及患者沟通确认后签署知情同意书并收取相关费用。
①补救ICSI前观察未受精卵成熟情况,了解过夜精子的情况,判断是否补救ICSI和是否发生污染。
②应及时完成补救ICSI。
③如实施补救ICSI,次日需先观察补救ICSI受精情况。
