实验十八　水产动物随机扩增多态性（RAPD）检测

实验十八　水产动物随机扩增多态性（RAPD）检测

一、实验目的

（1）掌握引物设计原理、PCR体系配制方法、电泳原理与结果分析方法。

（2）学习水产动物遗传多样性检测的RAPD方法，加深对生物多样性的理解。

二、实验原理

RAPD技术，即随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA）技术，以PCR技术为基础，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的全部DNA进行PCR扩增，以检测多态性。它是1990年美国杜邦公司科学家J．G．K．Williams和加利福尼亚生物研究所J．Welsh分别领导的一个小组几乎同时发展起来的一项新技术。与常规PCR相比，RAPD主要有以下特点：①无须专门设计RAPD扩增反应的引物，也无须预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9～10个寡核苷酸。②每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。③退火温度较低，能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。④较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。

三、实验材料

贝类、海参、鱼类模板DNA（10～100ng）。

四、实验用具和试剂

1．仪器用具

PCR扩增仪，电泳装置，离心机，移液器（1～20mL和20～200mL），0．5 mL Eppendorf管，凝胶成像系统等。

2．药品试剂

寡核苷酸引物（20mmol·L^-1贮存液），0．2mmol·L^-1dNTPs，Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液（500mmol·L^-1KCl，15mmol·L^-1MgCl₂，100 mmol·L^-1Tris·HCl，pH 8．3），矿物油，MgCl₂，电泳所需试剂等。

五、实验步骤

（1）在冰里向无菌的Eppendorf管中加入以下反应物（25mL反应体系）：

模板DNA　　　　　　　　　 　 1μL（50ng）　　

随机引物　　　　　　　　　　 1μL（约5pmol）

10×PCR Buffer　　　　　　　 2．5μL　　　　

MgCl₂　　　　　　 　　　　2μL　　　　　　

dNTP　　　　　　　　　　　　　2μL　　　　　　

Taq酶　　　　　　　　　　　　1单位（U）　　

加ddH₂O至　　　　　　　　　25μL　　　　　

混匀稍离心，加1滴矿物油。

（2）PCR反应：

94℃反应2min后开始如下循环：

94℃变性反应　　　1min

36℃退火反应　　　1min

72℃延伸反应　　　1min

经过45个循环后，最后一个循环72℃再延伸10min，循环结束后反应产物置于4℃下保存。

（3）取PCR产物15μL加3μL上样缓冲液（6×）于1％琼脂糖胶上电泳，稳压50～100V（电压低条带整齐，分辨率高）。

（4）电泳结束，观察、拍照。

六、应注意的问题

（1）扩增偏差或无扩增。

（2）扩增结果差，条带模糊或难以辨认。

（3）电泳时一般RAPD带有5～15条，大小0．1～2．0kb。

（4）染色后凝胶背景太强影响分辨率。

（5）特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。

七、作业

（1）引物设计的原则是什么？

（2）分析不同PCR体系配制方法对结果的影响。

（3）掌握电泳原理与方法。

八、参考图谱

图18．1　RAPD电泳图例