附录6　分子遗传学部分常用试剂配方

附录6　分子遗传学部分常用试剂配方

一、CTAB Buffer

配制200mL CTAB Buffer：　　　　　　　终浓度　　　　　　MW

2-ME：0．4mL　　　　　　　　　　　　（0．2％V／V）　　 78．13

CTAB：4g　　　　　　　　　　　　　　（2％W／V）　　　　 364．5

1MTris-Cl（母液）：20mL　　　　　　 （100mM，pH8．0）　　121．4

0．25MEDTA（母液）：16mL　　　　　　（20mM，pH8．0）　 　372．24

NaCl：16．363g　　　　　　　　　　　（1．4M）　　　　　 58．44

定容至200mL

注明：灭菌保存，使用前加入2-ME

二、细胞核DNA荧光素定量染色缓冲液

PBS缓冲液内加入3　000URNA酶和10μmol·mL^-1碘化乙锭（PI）或DAPI。

三、1MTris-HCl（pH 7．4，7．6，8．0）

称量121．1g Tris置于1L烧杯中。加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH。将溶解定容至1L。高温高压灭菌后，室温保存。

pH 　　　　浓HCl

7．4　　　约70mL

7．6　　　约60mL

8．0　　　约42mL

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH，因为Tris溶液的pH随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的pH大约降低0．03个单位。

四、0．5MEDTA（pH 8．0）

称取186．1g Na₂EDTA·2H₂O，置于1L烧杯中。加入约800mL的去离子水，充分搅拌。用氢氧化钠调节pH至8．0（约20g氢氧化钠）。加去离子水将溶液定容至1L。适量分成小份后，高温高压灭菌。室温保存。

注意：pH至8．0时，EDTA才能完全溶解。

五、10×TE Buffer（pH 7．4，7．6，8．0）

量取1MTris-HCl Buffer（pH 7．4，7．6，8．0）100mL，500mM EDTA（pH 8．0）20mL置于1L烧杯中。向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。将溶液定至1L后，高温高压灭菌。室温保存。

六、3M醋酸钠（pH 5．2）

称取40．8g NaAc·3H₂O置于100～200mL烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解。加入冰乙酸调节pH至5．2。加入去离子水将溶液定容至100mL。高温高压灭菌后，室温保存。

七、Tris-HCl平衡苯酚

大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无须重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。同时，应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此，苯酚的质量对DNA，RNA的提取极为重要。由于在酸性pH条件下DNA分配于有机相，因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH达到7．8以上。苯酚平衡操作方法如下：

液化苯酚应贮存于-20℃，此时的苯酚呈现结晶状态。从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温，然后在68℃水浴中使苯酚充分溶解。加入羟基喹啉（8-Quinolinol）至终浓度0．1％。该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的螯合剂，同时因其呈黄色。有助于方便识别有机相。加入等体积的1MTris-HCl（pH 8．0），使用磁力搅拌器搅拌15min，静置使其充分分层后，除去上层水相。重复操作数次。然后加入等体积的0．1M Tris-HCl（pH 8．0），使用磁力搅拌器搅拌15min，静置使其充分分层后，除去上层水相。重复操作数次。稍微残留部分上层水相。使用pH试纸确认有机相的pH大于7．8。将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存。

苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱中进行，与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。

八、苯酚∶氯仿∶异戊醇

从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离，而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。将Tris-Hcl平衡苯酚与等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）均匀混合后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。

九、10×TBE Buffer（pH 8．3）

称取Tris　108g、Na₂EDTA·2H₂O　7．44g和硼酸55g，置于1L烧杯中。加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。

十、溴化乙锭（10mg·mL^-1）

称取1．0g溴化乙锭，加入到200mL容器中。加入去离子水100mL，充分搅拌数小时完全溶解溴化乙锭。将溶液转入棕色瓶，室温避光保存。溴化乙锭最终工作浓度为0．5μg·mL^-1。

十一、6×DNA Loading Buffer（双染料）

称取溴酚兰25mg和二甲苯腈蓝FF　25mg置于15mL塑料离心管中。向离心管中加入6mL去离子水，充分搅拌溶解。加入3mL甘油混匀，最终用去离子水定容至10mL，室温保存。