实训4 微生物细胞形态的观察（一）——简单染色和革兰氏染色
实训4 微生物细胞形态的观察（一）——简单染色和革兰氏染色
一、实训目的
能够对细菌样本进行简单染色和革兰氏染色，并了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类中的重要性。
二、实训原理
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用如碱性美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等碱性染料使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法只用一种染料使细菌着色以显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christian Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G＋）和革兰氏阴性菌（G－）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。革兰氏染色法的原理详见模块二项目2．1下的任务2。
三、实训器材
1．材料
培养12～16h的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），培养24h的大肠杆菌（Escherichia coli），培养24h的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）。
2．染色剂和试剂
碱性美蓝染液、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红染液、复红染液、二甲苯、香柏油。
3．器具
废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
四、实训步骤
1．简单染色
（1）涂片：取干净载玻片一块，于中央加一滴生理盐水或无菌水，将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后，取枯草芽孢杆菌试管斜面一支，按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2～3环涂在中央制成薄的涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。如果是液体培养物则不必加水，直接取菌液1～2环涂片，接种环经灭菌后放回原处。无菌操作及涂片过程见图2－2。
（2）干燥：让涂片自然晾干或将载玻片置于酒精灯火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。
（3）固定：手执涂片一端，让菌膜朝上，快速通过火焰2～3次，使菌体固定于载玻片上（用手接触涂片反面，以不烫手为宜）。待载玻片冷却后，再加染液。
（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）番红染液或碱性美蓝染液于菌膜部位，染色1～2min。
（5）水洗：倾去染色液，用洗瓶中的自来水自载玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。
（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中自然晾干或用吸水纸吸去载玻片上多余的水分（注意不要将菌体擦去），自然晾干或在离火焰较远处微热烘干。
（7）镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，再用油镜观察细菌的形态。
2．革兰氏染色
（1）涂片：挑取少许大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别涂片（涂片一定要非常薄）。也可采用“三区”涂片法，即在玻片中央偏左和偏右各加一滴无菌水，先挑去少量的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在左、右两边分别涂片后，再将左、右两边的菌液延伸于中央区，使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌相互混合。
（2）干燥：与简单染色法相同。
（3）固定：与简单染色法相同。(https://www.daowen.com)
（4）草铵酸结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面为准）的草铵酸结晶紫染液染色1～2min。
（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
（6）媒染：滴加卢戈氏碘液，媒染1min。
（7）水洗：用水洗去碘液。
（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色，至流出液刚刚不出现紫色时即停止（约0．5min），立即用水洗净乙醇，并轻轻吸干。
（9）复染：滴加番红染液复染2min。
（10）水洗：用水洗去涂片上的番红染液。
（11）干燥：与简单染色法相同。
（12）镜检：镜检时先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌常常由于脱色不完全而呈假阳性。
革兰氏染色过程见图2－3。
实验完毕后，将浸过油的镜头用二甲苯按要求擦拭干净。使用后的染色玻片用吸水纸将香柏油擦干净，再用洗衣粉刷洗，最后用水冲洗干净。
五、结果记录
列表简述3株细菌的染色观察结果，说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色的反应。
六、注意事项
（1）革兰氏染色成败的关键是乙醇脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以明确规定。
（2）染色过程中勿使染液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染液被稀释而影响染色效果。
（3）选用幼龄的细菌。革兰氏阳性菌应培养12～16h，大肠杆菌应培养24h。若菌龄太老，菌体死亡或自溶常会使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
（4）固定操作。固定操作是革兰氏染色的关键操作。
七、思考题
（1）制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？
（2）如果涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎么样？
（3）哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
（4）现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请对其进行革兰氏染色反应。该如何运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明此染色结果的正确性？
（5）你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
（6）进行革兰氏染色时特别强调菌龄不能太老，用老龄菌染色会出现什么问题？
