实训5　微生物细胞形态的观察（二）——芽孢染色和荚膜染色

一、实训目的

掌握芽孢染色法和荚膜染色法，初步了解芽孢杆菌的形态特征及荚膜的特征。

二、实训原理

芽孢又叫内生孢子（endospore），是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆形或椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。

芽孢染色和荚膜染色的基本原理见模块二项目2．1下的任务3。

三、实训器材

1．菌种

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）培养约2天营养琼脂斜面培养物，球形芽孢杆菌（B．sphaericus）培养1～2天营养琼脂斜面培养物，胶质芽孢杆菌（B．mucilaginosus）或褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）培养约2天无氮培养基琼脂斜面培养物。

2．染色剂和试剂

5%孔雀绿溶液，0．5%番红溶液，绘图墨水，1%甲基紫溶液，1%结晶紫溶液，6%葡萄糖溶液，甲醇。

3．器具

小试管，滴管，烧杯，试管架，载玻片，盖玻片，木夹子，滤纸，显微镜等。

四、实训步骤

1．芽孢染色

（1）制片：按常规制片法涂片、干燥、固定。

（2）染色：加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹子夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸汽并开始计时，维持5min。加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。

（3）水洗：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水呈无色为止。勿用流水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。

（4）复染：用番红染液复染2min。

（5）水洗：用缓流水洗后吸干。

（6）镜检：干后用低倍镜和高倍镜观察，最后用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。(https://www.daowen.com)

2．荚膜染色

1）湿墨水法

（1）制备菌和墨水混合液：加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。

（2）加盖玻片：将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。加盖玻片时勿留气泡，以免影响观察。

（3）镜检：用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察效果更好。观察到背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。

2）干墨水法

（1）制混合液：加一滴6%葡萄糖溶液于洁净载玻片的一端，然后挑取少量菌体与其混合，再加一滴墨水，充分混匀。玻片必须洁净无油渍，否则涂片时混合液不能均匀散开。

（2）涂片：另取一端边缘光滑的载玻片作为推片，将推片一端的边缘置于混合液前方，然后稍向后拉，当推片与混合液接触后，轻轻左右移动，使之沿推片接触的后缘散开，然后以大约30°的夹角迅速将混合液推向玻片另一端，使混合液铺成薄层（图2－4）。

（3）干燥：将涂片放于空气中自然干燥。

（4）固定：用甲醇浸没涂片固定1min，倾去甲醇。

（5）干燥：将涂片放于酒精灯上方用文火干燥或自然干燥。

（6）染色：用甲基紫染1～2min。

（7）水洗：用自来水轻轻冲洗，自然干燥。

（8）镜检：用低倍镜和高倍镜观察。观察到背景灰色，菌体紫色，菌体周围的清晰透明圈为荚膜。

五、结果记录

（1）绘图表示所观察到的芽孢杆菌的形态特征（注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形状特征）。

（2）绘图说明所观察到的细菌菌体和荚膜形态。

六、思考题

（1）说明芽孢染色的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？

（2）若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊和营养细胞，原因是什么？

（3）通过荚膜染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？