实训7 微生物细胞形态的观察（四）——酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数
实训7 微生物细胞形态的观察（四）——酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数
一、实训目的
（1）学习掌握酵母菌死活细胞的鉴别方法。
（2）了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，学习使用血球计数板计酵母菌细胞数的原理和方法。
二、实训原理
1．酵母菌的死活细胞鉴别
酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大，不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍采取的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而代谢作用微弱的活细胞和死细胞还原能力极弱或无此还原能力，因此被美蓝染成淡蓝色或蓝色。用此法不仅可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。但应注意，美蓝的浓度、染色时间等均可影响制片染色的效果。
2．酵母菌的镜检计数
测定微生物细胞数量的方法很多，对于单细胞的微生物如细菌、酵母菌，显微直接计数法是通常采用的方法之一，即用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。此法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察，而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成。玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其他平面略低，正中央还有一垂直小槽，槽的两边的平面上各刻有9个大方格（图3－10）。中间的一个大方格为计数室，它的长、宽各为1mm，深度为0．1 mm，容积为0．1mm3。每个小方格的体积为1／4000mm3。计数室有两种规格，一种是把大方格分成16个中格，每一中格分成25小格，即16×25型，共计400小格；另一种是把大方格分成25个中格，每一中格分成16小格，即25×16型，总共也是400小格。
图3－10 血球计数板结构
（a）平面图；（b）侧面图；（c）25×16型计数室；（d）16×25型计数室
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
16×25型血球计数板的计算公式：
25×16型血球计数板的计算公式：
三、实训器材
1．酵母菌
酿酒酵母或卡尔酵母培养2天左右的麦芽汁（或豆芽汁）液体培养物。
2．染色剂
0．05%或0．1%吕氏碱性美蓝染液、革兰氏染色用的碘液。
3．器具(https://www.daowen.com)
显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种针，酒精灯，擦镜纸等。
四、实训步骤
1．酵母菌的死活细胞鉴别
（1）染色：在干净的载玻片中央加一小滴0．05%或0．1%吕氏碱性美蓝染液，以无菌操作用接种环挑取少量酵母菌放于美蓝染液中，混合均匀，取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。染液和菌液不宜过多或过少，应基本等量，而且要混匀。
（2）镜检：将制好的染色片置于载物台上，放置约3min进行镜检，先用低倍镜后用高倍镜进行观察，按照细胞颜色区分死细胞（蓝色）和活细胞（无色），并进行记录。
（3）观察：染色约30min后再次进行观察，注意死细胞数目是否增加。
2．酵母菌的镜检计数
（1）检查血球计数板：取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸的菌体，若有污物则通过冲洗使其清洁。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。
（2）稀释样品：将培养后的酵母培养液振荡混匀，然后作一定倍数的稀释。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。
（3）加样：取一块干净盖玻片盖在计数板中央。用滴管取1滴菌稀释悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。静置5～10min。
（4）镜检：待细胞不动后进行镜检计数。先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜计数。一般应取上、下及中央五个中格的总菌数。计数时若遇到位于线上的菌体，一般只计格上方（下方）及右方（左方）线上的菌体。每个样品重复3次。
（5）计算：取以上计数的平均值，按公式计算出每毫升菌液中的含菌量。
（6）清洗：计数板用完后先用95%的酒精轻轻清洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，晾干后即可。若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶液中进行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。
五、结果记录
（1）绘图说明观察到的酵母形态特征，并标明酵母菌细胞死活类型。
（2）记录所观察到的细胞数并计算出每毫升菌液中的含菌量，填入表3－5。
表3－5 菌细胞的计数及计算
注意，此计数法计上不计下，计左不计右。且无法区分死活细胞。
六、思考题
（1）吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。
（2）根据自身的体会，血球计数板计算的误差主要来自哪些方面？应如何减少误差？
