实训18 细菌生理生化反应（二）——试纸法
实训18 细菌生理生化反应（二）——试纸法
一、实训目的
（1）了解试纸法的原理及方法步骤。
（2）培养学生的创新意识。
二、实训原理
细菌鉴定中的生理生化反应常规法，其人力、材料、时间等花费较大，有一定不足。试纸法是先将一些参加生理生化反应的物质，如各种糖类及尿素等，做成试纸，然后在一种通用培养基（这种培养基只需煮沸，不需高压灭菌）上，同时进行几个项目检测，数小时后可观察结果。
三、实训器材
1．菌种
产气杆菌、大肠杆菌和变形杆菌。
2．培养基
蛋白胨琼脂粉（通用培养基）：蛋白胨（未受潮）100g，琼脂粉100g，NaCl 50g，K2HPO4·3H2O 25g，磨细、混匀，装入瓶内，塞紧瓶塞，于干燥处保存备用。
3．试纸
含葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、尿素的滤纸。
4．试剂
1mol／L NaOH溶液，0．4%酚红指示剂。
5．器皿
烧杯，量筒，培养皿4个，无菌吸管（1mL 3支，5mL 1支），台秤，恒温水浴锅。
6．其他
无菌水1瓶，镊子，牛角药匙。
四、实训步骤
1．配培养基
称取备用的蛋白胨琼脂粉2．7g（或按配方直接称取），倒入烧杯中，加水100mL，加热熔化，煮沸10min（注意水分的损失）。
2．调pH
用1mol／L的NaOH溶液调pH至7．0，加入0．4%酚红指示剂，再用NaOH溶液调节，以使培养基的颜色呈橙黄色为宜，此时pH约为7．2。如果培养基过碱，菌体长不出或长不好；如果过酸，结果不明显。调好后，置于50℃左右水浴锅中，备用。
3．制备菌液
用5mL无菌吸管分别吸取2mL无菌水到测试菌斜面上，将菌体洗下打碎，制成菌液。
4．编号
将4个培养皿编号，其中1个作为空白。
5．倒平板
用1mL无菌吸管分别吸1mL菌液到相应的培养皿中，同时倒入已熔化的培养基于培养皿中，立即摇匀，放置凝固。空白对照不放菌液，直接倒入培养基。(https://www.daowen.com)
6．放试纸
平板凝固后，用镊子将试纸按图3－26所示位置放到琼脂表面上。
图3－26 试纸排列示意图
7．培养
试纸放好后，倒置于37℃恒温箱中培养。
8．结果观察
2．5h后开始观察，一般3～4h结果就很明显。
（1）糖的利用：若某一试纸片周围出现黄色，表明其利用该糖产酸；如在黄色圈内又有气泡或裂隙出现，表明产气；无任何变化者表明不利用该糖。
（2）尿素分解：尿素试纸片周围出现紫红色者为阳性反应。
9．注意事项
（1）试纸片可长期保存，长期使用。培养基可随配随用，不需灭菌，只需临时熔化煮沸。
（2）菌液的浓度越大，结果越明显。
（3）及时、连续地观察是做好本次实验的关键，特别是2．5～4h期间的结果观察。若时间太长，琼脂表面上的结果就看不出来了。
五、结果记录
将实验结果填入表3－9中（用“＋”表示阳性结果，“＋”表示阳性且产气，用“－”表示阴性结果）：
表3－9 细菌生理生化反应试纸法结果
附：试纸片的制作方法
（1）用乙醇分别配制苏丹Ⅲ（红）、姜黄素（黄）、醇溶性苯胺蓝（蓝）和苏丹黑（黑）的饱和溶液，再以1∶5的比例将醇溶性苯胺蓝和姜黄素液混合配成绿色溶液。
（2）将上述各色溶液分别倒入干净的瓷盘中，把剪成条状的新华1号滤纸浸入溶液内，浸透染色，然后拿出干燥成带色试纸。
（3）配制浓度为20%的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖的水溶液，10%尿素水溶液。
（4）将上述各种溶液分别倒入干净的瓷盘中，按下列顺序分别浸泡带色试纸：红色试纸浸葡萄糖、黄色试纸浸乳糖、蓝色试纸浸麦芽糖、黑色试纸浸蔗糖、绿色试纸浸尿素。
（5）浸好以后，拿出干燥，即成各种带色试纸。然后用6mm打孔器打成圆形纸片，放入小瓶内，置室温下避光保存备用。
六、思考题
（1）试比较常规法与试纸法的优缺点。
（2）为什么本实训的结果要及时、连续地进行观察？
