实训17 细菌生理生化反应（一）——常规法
实训17 细菌生理生化反应（一）——常规法
一、实训目的
（1）了解细菌生理生化反应（常规法）的基本原理。
（2）掌握几种常用细菌生理生化反应的实验方法。
二、实训项目
（一）单糖发酵试验
1．基本原理
绝大多数细菌都能够利用糖类作为碳源和能源，但是它们分解糖类物质的能力却有很大差异，有些细菌能够分解某种单糖产生有机酸（如乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和琥珀酸等）和气体（如氢气、甲烷和二氧化碳等），而有些细菌只产酸不产气。借此可协助鉴别菌种，尤其是在肠道细菌的鉴定中经常使用。
2．仪器与材料
1）菌种
大肠杆菌、产气肠杆菌和伤寒沙门菌。
2）培养基
葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基。
图3－22 单糖发酵试验产气情况
（a）培养前情况；（b）、（c）培养后小管中出现气体
3）试剂
0．4%溴麝香草酚蓝指示剂：取溴麝香草酚蓝0．4g，加1mol／L NaOH溶液0．64 mL，研磨，加蒸馏水稀释至100mL，备用。pH变色范围为6．3～7．2。
4）其他
试管（德汉氏小管，以判断产气情况，见图3－22），接种环，酒精灯，高压蒸汽灭菌器和恒温培养箱等。
3．试验方法
1）试验准备
配制葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基，分装至试管（装量以没过德汉氏小管为宜），灭菌后备用。
2）接菌
以无菌操作技术将大肠杆菌、产气肠杆菌、伤寒沙门菌分别接入两种单糖发酵培养基中。
3）培养
将已接菌的试管和未接菌的对照管置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察结果。
4．试验结果
1）对照管
培养基澄清，呈绿色，德汉氏小管内无气泡。
2）大肠杆菌
葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基试管中液体均浑浊，颜色变为黄色，德汉氏小管内有气泡，证明此菌发酵葡萄糖和乳糖，既产酸又产气。
3）产气肠杆菌
葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基试管中液体均浑浊，颜色变为黄色，德汉氏小管内有气泡，证明此菌发酵葡萄糖和乳糖，既产酸又产气。
4）伤寒沙门菌
葡萄糖发酵培养基试管中液体浑浊，颜色变为黄色，德汉氏小管内无气泡，证明此菌发酵葡萄糖只产酸不产气。乳糖发酵培养基试管中现象与对照管相同，证明此菌不能发酵乳糖。
（二）吲哚试验
1．基本原理
有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚本身没有颜色，不能直接观察，所以加入对二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。反应如下：
2．仪器与材料
1）菌种
大肠杆菌、产气肠杆菌。
2）培养基
蛋白胨水培养基。
3）试剂
柯氏试剂：称取5g对二甲基氨基苯甲醛加入到75mL戊醇内，置56℃水浴，不断摇动使其溶解，取出冷却后徐徐滴入浓盐酸25mL，滴加时随滴随摇，以免骤热。配好时颜色较深，放置一夜即成淡褐色透明液体。保存于4℃冰箱中备用。
4）其他
试管，滴管，接种环，酒精灯，高压蒸汽灭菌器和恒温培养箱等。
3．试验方法
1）试验准备
配制蛋白胨水培养基，分装至试管，灭菌后备用。
2）接菌
以无菌操作技术将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入蛋白胨水培养基中。
3）培养
将已接菌的试管和未接菌的对照管置于37℃恒温培养箱中培养24h。
4）观察结果
每管加入3～5滴柯氏试剂，轻轻振摇，使戊醇分散于液体中，将培养物静置，待戊醇升至培养液液面后，如吲哚存在即可被提取至戊醇层中，反应呈玫瑰红色者为阳性，仍呈黄色者为阴性。
4．试验结果
1）对照管
培养基澄清，呈黄色。
2）试验管
大肠杆菌：试管中液体浑浊，颜色为黄色。
产气肠杆菌：试管中液体浑浊，颜色为黄色。
3）加入柯氏试剂
大肠杆菌：试管中液体上层出现玫瑰红色，吲哚试验阳性。
产气肠杆菌：试管中液体未出现红色，吲哚试验阴性。
5．注意事项
玫瑰吲哚与水不互溶而溶于有机溶剂，可被萃取在所加入的柯氏试剂层中。所以观察结果时，振荡后应静置观察，只在液面上层出现玫瑰红色。
（三）甲基红试验
1．基本原理
大肠杆菌和产气肠杆菌在糖代谢中都能够分解葡萄糖产生丙酮酸。产气肠杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇，故培养基中形成的酸类较少，pH可在5．4以上，因此加入甲基红指示剂呈现黄色，为甲基红试验阴性。而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸，产生的酸类较多，使培养基的pH在4．5或更低，故甲基红指示剂呈现红色，为甲基红试验阳性。
2．仪器与材料
1）菌种
大肠杆菌、产气肠杆菌。
2）培养基
葡萄糖蛋白胨水培养基。
3）试剂
甲基红指示剂：称取甲基红0．1g，溶于300mL 95%乙醇后，加蒸馏水200mL。
4）其他
试管，滴管，接种环，酒精灯，高压蒸汽灭菌器和恒温培养箱等。
3．试验方法
1）试验准备
配制葡萄糖蛋白胨水培养基，分装至试管，灭菌后备用。
2）接菌
以无菌操作技术将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入葡萄糖蛋白胨水培养基中。
3）培养
将已接菌的试管和未接菌的对照管置于37℃恒温培养箱中培养48h。
4）观察结果
每管加5滴甲基红指示剂，立即观察，阳性者呈红色，阴性者呈黄色。
4．试验结果
1）对照管
培养基澄清，呈黄色。
2）试验管
大肠杆菌：试管中液体浑浊，颜色为黄色。
产气肠杆菌：试管中液体浑浊，颜色为黄色。
3）加入甲基红指示剂
大肠杆菌：试管中液体变为红色，甲基红试验阳性。
产气肠杆菌：试管中液体仍为黄色，甲基红试验阴性。
5．注意事项
在配制培养基时，pH要调节适当，不能过高，pH过高会影响对最终产酸量的判断，出现假阴性，未使甲基红变红。
（四）乙酰甲基甲醇试验
1．基本原理
乙酰甲基甲醇（Voges－Proskauer，V－P）试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖能否产生乙酰甲基甲醇，主要用于鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。大多数细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸的分解产物则因细菌不同而有区别。产气肠杆菌可使丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下被空气中的氧气氧化生成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即V－P试验阳性，不产生红色化合物者为阴性反应。有时为了使反应更为明显，可以加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。在试验时加入α－萘酚可加速这个反应。
V－P试验化学反应过程大致如下：
2．仪器与材料
1）菌种
大肠杆菌、产气肠杆菌。
2）培养基
葡萄糖蛋白胨水培养基。
3）试剂
40%NaOH溶液、6%α－萘酚溶液。
4）其他
试管，移液管，接种环，酒精灯，高压蒸汽灭菌器和恒温培养箱等。
3．试验方法
1）试验准备
配制葡萄糖蛋白胨水培养基，定量分装至试管（2mL／管），灭菌后备用。
2）接菌
以无菌操作技术将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入葡萄糖蛋白胨水培养基中。
3）培养
将已接菌的试管和未接菌的对照管置于37℃恒温培养箱中培养48h。
4）观察结果
每管加入0．4mL 40%NaOH溶液和1mL 6%α－萘酚溶液，混匀，在室温下静置5～15min，如出现红色者为阳性反应。(https://www.daowen.com)
4．试验结果
1）对照管
培养基澄清，呈黄色。
2）试验管
大肠杆菌：试管中液体浑浊，颜色为黄色。
产气肠杆菌：试管中液体浑浊，颜色为黄色。
3）在室温下静置
大肠杆菌：试管中液体仍为黄色，V－P试验阴性。
产气肠杆菌：试管中液体变为红色，V－P试验阳性。
5．注意事项
（1）培养基定量分装，在观察结果时试剂也应定量加入，其结果准确可靠。
（2）观察结果时，加完试剂需开盖充分振荡，此步反应是与空气中的氧气接触氧化的过程。另外，此反应速度较慢，需5～10min后才能出现结果。
（五）柠檬酸盐利用试验
1．基本原理
肠杆菌科各种细菌利用柠檬酸盐的能力不同，有的细菌可以利用柠檬酸钠作为碳源，有的则不能，因此可以根据柠檬酸盐的利用情况对细菌进行鉴别。凡能利用柠檬酸盐者就能在此培养基上生长，并使培养基变为碱性，溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。
2．仪器与材料
1）菌种
大肠杆菌、产气肠杆菌。
2）培养基
柠檬酸盐琼脂培养基。
3）试剂
0．4%溴麝香草酚蓝指示剂：同单糖发酵试验。
4）其他
试管，接种环，酒精灯，高压蒸汽灭菌器和恒温培养箱等。
3．试验方法
1）试验准备
配制柠檬酸盐琼脂培养基，分装至试管，灭菌后摆成斜面备用。
2）接菌
以无菌操作技术将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入柠檬酸盐斜面培养基中。
3）培养
将已接菌的试管和未接菌的对照管置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察结果。
4．试验结果
1）对照管
培养基上未长菌，颜色仍为绿色。
2）试验管
大肠杆菌：试管中斜面上没有菌生长，培养基颜色仍为绿色，柠檬酸盐利用试验阴性。
产气肠杆菌：试管中斜面上有菌生长，培养基颜色变为深蓝色，柠檬酸盐利用试验阳性。
知识链接
IMViC试验
吲哚试验（indole test）、甲基红试验（methyl red test）、V－P试验（Voges－Proskauer test）和柠檬酸盐利用试验（citrate utilization test），简称IMViC试验（i是在英文中为了发音方便而加上去的），这四个试验常用于大肠杆菌和产气肠杆菌的鉴别。大肠杆菌作为食品和饮用水的粪便污染指示菌，若超过一定数量，则表示受粪便污染。产气肠杆菌存在于水、植物、谷物表面和食品中，也可以作为食品和饮用水的粪便污染指示菌。在检验时必须将大肠杆菌和产气肠杆菌区分开来，因为二者在形态、菌落、染色性、对糖发酵能力等方面十分相似，所以必须通过生理生化反应进行鉴别。典型大肠杆菌IMViC试验结果是“＋＋－－”，产气肠杆菌IMViC试验结果是“－－＋＋”。
（六）硫化氢试验
1．基本原理
有些细菌能够分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等）产生硫化氢，硫化氢遇到培养基中的乙酸铅或硫酸亚铁，能够生成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物，从而可确定硫化氢的产生。
以半胱氨酸为例，其化学反应过程如下：
2．仪器与材料
1）菌种
大肠杆菌、产气肠杆菌。
2）培养基
乙酸铅培养基。
3）其他
试管，接种针，酒精灯，高压蒸汽灭菌器和恒温培养箱等。
3．试验方法
1）试验准备
配制乙酸铅培养基，分装至试管，灭菌后备用。
图3－23 穿刺接种示意图
2）接菌
用穿刺接种法将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入乙酸铅培养基试管中。穿刺接种法：将已挑有菌的接种针（针必须很挺直），自培养基的中心垂直地刺入培养基中，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上棉塞，将接种针上残留的菌在火焰上烧掉（图3－23）。
3）培养
将已接菌的试管和未接菌的对照管置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察结果。
4．试验结果
1）对照管
培养基没有出现黑色沉淀线。
2）试验管
大肠杆菌：培养基没有出现黑色沉淀线，硫化氢试验阴性。
产气肠杆菌：培养基出现黑色沉淀线，硫化氢试验阳性。
（七）明胶液化试验
1．基本原理
不同细菌所含的酶系统不完全相同，对复杂有机大分子的分解能力也不相同。明胶是一种动物蛋白质，低于20℃呈固体，高于20℃自行液化呈液态。某些细菌可产生一种称为明胶酶的胞外酶，可使明胶破坏而失去凝固能力，在低于20℃的条件下也不凝固。利用这一特点可以帮助鉴别某些细菌。变形杆菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等能液化明胶，大肠杆菌和伤寒沙门菌则不能。
2．仪器与材料
1）菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
2）培养基
明胶液化培养基。
3）其他
试管，接种针，酒精灯，高压蒸汽灭菌器和恒温培养箱等。
3．试验方法
1）试验准备
配制明胶液化培养基，分装至试管，灭菌后备用。
2）接菌
用穿刺接种法将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接入明胶液化培养基试管中。
3）培养
将已接菌的试管和未接菌的对照管置于20℃恒温培养箱中培养5～7天，观察培养基有无液化及其液化后的形状（图3－24）。
图3－24 明胶液化形态图
4．试验结果
1）对照管
培养基没有出现液化现象。
2）试验管
大肠杆菌：培养基没有出现液化现象，明胶液化试验阴性。
枯草芽孢杆菌：培养基出现液化现象，明胶液化试验阳性。
（八）淀粉水解试验
1．基本原理
某些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
2．仪器与材料
1）菌种
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
2）培养基
淀粉培养基。
3）其他
培养皿，接种环，水浴锅，恒温培养箱等。
3．试验方法
1）试验准备
配制淀粉培养基，灭菌后备用。
图3－25 淀粉平板接种示意图
2）接菌
淀粉培养基在水浴中熔化后，冷至50℃，以无菌操作制成平板，用接种环取少量枯草芽孢杆菌在平板的一边划“十”字形接种，另取少量大肠杆菌在平板的另一边接种（图3－25）。
3）培养
将已接菌的平板置37℃培养箱中恒温培养16～20h。
4．试验结果
1）操作
打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，使碘液均匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，透明圈的大小即表明该菌水解淀粉能力的大小。
2）现象
大肠杆菌：菌周围没有出现无色透明圈，淀粉水解试验阴性。
枯草芽孢杆菌：菌周围出现无色透明圈，淀粉水解试验阳性。
三、思考题
（1）简述IMViC试验在微生物学检验上的意义。
（2）细菌生理生化反应试验中为什么设有空白对照组？
（3）现分离得到一株肠道细菌纯培养菌株，请结合本试验设计一个方案来鉴定。
