实训16　微生物的纯种分离（二）——涂布稀释分离法

实训16　微生物的纯种分离（二）——涂布稀释分离法

一、实训目的

（1）掌握涂布稀释分离法，并回顾倒平板的方法。

（2）学习从土壤中分离纯化放线菌。

二、实训原理

土壤是微生物生活的大本营，其中微生物的种类和数量都是极其丰富的，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。

放线菌与细菌同属原核微生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌，尤其是在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中数量较多。

本实验采用高氏Ⅰ号琼脂培养基，通过涂布稀释分离法分离纯化菜园土中的放线菌。

三、实训器材

1．材料

菜园土样，高氏Ⅰ号琼脂培养基。

2．器具

盛9mL无菌水的试管，盛90mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶，无菌吸管，无菌培养皿，显微镜，无菌铲，无菌塑料袋，无菌玻璃涂棒。

3．试剂

10%苯酚，无菌水。

四、实训步骤

1．倒平板

按实训15中的方法以高氏Ⅰ号琼脂培养基制备平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。(https://www.daowen.com)

2．制备土壤稀释液

按实训15中的方法制备土壤稀释液（土样采集时取菜园土），并用记号笔标明稀释倍数、土样编号和实验日期。

3．涂布

将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10－4、10^－5、10－6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10^－4、10^－5、10^－6三管土壤稀释液中各吸取0．1mL对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒进行涂布，在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10min，使菌液吸附浸入培养基。

平板涂布方法：将0．1mL菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置，右手拿无菌玻璃涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀（图3－21）。

图3－21　平板涂布法

4．培养

将上述接种过土壤悬液的平板倒置于28～30℃培养箱中培养4～5天。

5．挑菌纯化

从平板中选择分离较好的放线菌菌落（应与细菌菌落区别开）转接斜面，并制片作纯度检查，若不纯，应进一步将该菌作涂布稀释分离或平板划线分离，直至获得纯培养。

五、结果记录

（1）是否分离纯化得到了较好的放线菌？若不是，请分析原因并重做。

（2）菌种保存：挑取典型放线菌菌落接种于高氏Ⅰ号斜面培养基上，在28～30℃下培养5～7天，然后置于4℃冰箱中保存。

六、思考题

若需要从酒曲中分离酵母菌，该如何操作？请简述其原理和方法。