【实验目的】
（1）掌握蛋白质电泳技术的基本原理及血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的基本方法。
（2）熟悉醋酸纤维薄膜电泳的基本操作。
（3）了解血浆蛋白电泳的临床意义。
【实验原理】
带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极方向泳动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。血清中各种蛋白质的等电点在pH 4.0～7.3，在pH 8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢。
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
采用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法，称为醋酸纤维素薄膜电泳。该膜具有均一的泡沫状结构（厚约120 μm），渗透性强，对分子移动的阻力很弱。用其作支持物进行电泳，具有微量、快速、简便、分离清晰、对样品无吸附现象等优点。现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。
经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。
血清蛋白质的等电点和分子量见表7-8。
表7-8 血清蛋白质的等电点和分子量
【实验试剂与器材】
1. 实验试剂
（1）巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH 8.6，0.07 mol/L，离子强度0.06）：称取1.66 g巴比妥和12.76 g巴比妥钠，置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600 mL，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1 000 mL。置4 °C保存，备用。
（2）0.5% 氨基黑10B染色液：称取0.5 g氨基黑10B，加蒸馏水40 mL，甲醇50 mL，冰乙酸10 mL，混匀溶解后置具塞试剂瓶内储存。
（3）漂洗液：取95%乙醇45 mL，冰乙酸5 mL和蒸馏水50 mL，混匀置具塞试剂瓶内储存。
（4）健康人血清。
2. 实验器材
（1）电泳仪：为电泳提供直流电源。
（2）电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。
（3）醋酸纤维素薄膜：2 cm×8 cm。
（4）其他：培养皿（直径9～10 cm）、滤纸、盖玻片、镊子等。
【实验步骤】
1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择
将醋酸纤维薄膜迎着光辨别粗糙面与光滑面，在粗糙面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线。将薄膜粗糙面朝下放入缓冲液中浸泡约20 min，整条薄膜颜色一致且无白色斑点，方可用于点样。(https://www.daowen.com)
2. 点 样
用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸去多余的缓冲液，然后平铺于滤纸上（粗糙面朝上）。用盖玻片一侧蘸上血清样品（连续、均匀、适量），将此边缘按压在点样线上，样品应点在薄膜的粗糙面一侧。待血清完全渗入薄膜后即可进行电泳，如图7-11所示。
图7-11 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）
3. 制作滤纸桥
在电极槽中，倒入电极缓冲液（巴比妥-巴比妥钠缓冲液，pH 8.6）。在电泳槽的两个膜支架上各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥，如图7-12所示。
4. 电 泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上，如图7-12所示。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳仪，在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3 mA/cm膜宽度（24片薄膜则为14.4 mA）。通电5 min后，调节电流强度0.5 mA/cm膜宽度（24片薄膜则为24 mA），电泳时间50 min。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。
图7-12 醋酸纤维薄膜电泳装置示意图
5. 染色与漂洗
电泳完毕后将薄膜取下，放在染色液中浸泡5 min。将薄膜从染色液中取出，用水冲洗后，移至漂洗液中漂洗，直至可清晰分辨出5条色带，如图7-13所示。
6. 记录和分析实验结果
漂洗完毕后将薄膜取出，放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述和记录，并判断分析其结果。
图7-13 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图
【注意事项】
（1）薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。
（2）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。
（3）点样时动作要轻，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
（4）点样应点在薄膜的粗糙面上，点样量要适量，不宜过多或过少。
（5）电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。
（6）染色时需注意时间的控制。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。
【讨论与思考】
（1）电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？根据人血清中各蛋白组分的性质，如何估计它们在pH 8.6的巴比妥-巴比妥钠电泳缓冲液中的相对迁移速度？
（2）简述醋酸纤维素薄膜电泳的原理和优点。
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