4．5 精液免疫学检测
精液免疫学检测一般应先进行精子与宫颈黏液相互作用检查，然后再行精液抗原或抗体的检测，以及精浆免疫抑制物测定。目前虽有很多方法来测定这些物质，但由于检测方法的原理和所用试剂的差别，在灵敏性及假阳性率等方面不同，从而导致结果有差异。表4．9显示用间接免疫荧光试验（I－IFT）、精子制动试验（SIT）和精子凝集试验（TAT）对血清（273样品）、精浆（88样品）及宫颈黏液（56样品）检测的不同结果［22］。由此可见，抗精子抗体在不同类型的标本中阳性率有差别，同样的样本如果选择的方法不同也会导致结果差异性。例如血清样品中，TAT阳性检出率稍低，而精浆样品，I－IFT阳性检出率较高，但对宫颈黏液样品，SIT的阳性检出率较低。参考文献［23］报道，对524例不育患者的精液分别使用混合抗球蛋白凝集试验（MAR），精子凝集试验（TAT）方法检测抗精子抗体，结果MAR法阳性率5．70%，TAT法阳性率为12．2%，两者之间存在统计学差异（P＜0．01）。重要的是这些测定到的抗体或物质有些可引起精子质量的改变以致不育，有些可能不会引起不育。因此，近年来更关注各种检测方法的价值及测试方法的标准化。世界卫生组织（WHO）最新出版的《人类精液检验与处理实验室手册》第五版［24］，对精液免疫学检测就只推荐了精子与宫颈黏液相互作用的检测和精子包被抗体的检测。精液免疫学检测比较复杂，需要有相应的实验设备以及培养有关的技术人员，这样取得的检测结果才具有可信性。本节从临床和实验角度介绍WHO推荐的实验方法及意义，同时也简单介绍一些其他实验。
表4．9 3种方法检测抗精子抗体阳性率统计（刘向东等，2005）
I－IFT，间接免疫荧光试验；SIT，精子制动试验；TAT，试管凝集试验。
4．5．1 精子－宫颈黏液相互作用试验
在两次月经间的中期，雌激素使宫颈黏液变得稀薄易为精子穿透，此时精子才有可能在这一十分有限时间内穿透宫颈黏液。精子穿透宫颈黏液的时间长短差异很大，是因妇女个体而异；即使同一个体，不同的月经周期也不尽相同。因此，只有对不同月经周期进行重复试验，才能对精子－宫颈黏液相互作用的异常情况作出结论。
4．5．1．1 体内试验
（1）目的：评估性交后宫颈黏液中精子存活数目和精子的活动情况，用来评价男性或其女性伴侣抗精子抗体阳性的意义。
（2）时间选择：尽可能靠近排卵期（一般在两次月经的中间时点）进行，排卵期可以根据一些临床指征，如一般情况下的正常月经周期来月经后的14天，观察基础体温、宫颈黏液的变化情况，进行阴道细胞学检查，以及血清或尿中雌激素水平及卵巢超声排卵检查等。对于一个实验室来说，重要的是使性交后检查宫颈黏液的时间标准化，这个时间应是9～14小时。
（3）指导患者：对于准备进行性交后试验的男性对象应告知进行检测的最适时间，同时告知下述事项：
1）试验前至少2天男方要避免性生活或手淫。
2）在约定检验时间的前一天晚上同房。
3）在同房的过程中不能使用任何阴道润滑剂，也不能在性交后进行阴道冲洗。
4）次日向医生报告可以进行检验。
（4）取样步骤
1）先置入未使用润滑剂的阴道窥器。
2）用不带针头的注射器、移液管或聚乙烯管在阴道后穹窿部吸取混合样本。
3）再用另一个注射器或导管吸取宫颈管内的黏液标本。
4）将两次取样标本分别滴一滴置于载玻片上用盖玻片铺平，并标记好来源。
（5）光学显微镜下观察
1）阴道中的精液样品：精子在阴道内2个小时就会失活。观察阴道中精子涂片的目的是保证精液确实曾存在于阴道内。
2）宫颈黏液样品：精子在宫颈管较低位置上的数量取决于时间长短。在性交以后的2～3小时之内，有大量精子储积在子宫颈管的较低位置。对穿过宫颈黏液的精子数目的评估一般采用高倍镜视野下所见精子数目计数的方法。推荐以黏液中的精子浓度（精子数／mm3）为标准的表示单位。
精子在子宫颈黏液中的活力分级如下：
a．快速前向运动性精子（progressive motility，PR）；
b．非快速前向运动性精子（non－progressive motility，NP）；
c．不活动精子（immotile spermatozoa，IM）。
正常宫颈黏液的最重要指标是在其中存在快速前向运动的精子数。
（6）注意事项
1）如果在黏液中未发现精子则为测试阴性。
2）排除其他明显的宫颈因素，如果在性交后9～14小时内没有在宫颈黏液内发现快速前向运动精子，提示男方或女方可能存在抗精子抗体。
3）如观察到非快速前向运动精子表现为一种颤动现象时，则可推断宫颈黏液或精子表面存在抗体。
4．5．1．2 体外实验
通常当性交后试验结果异常时才进行这些体外试验。需注意以下几点：
1）当精液－子宫颈黏液相互作用试验的目的是比较不同子宫颈黏液标本的质量时，应使用单一的正常精液样本。
2）当评估几个精液标本的质量时，应该使用同一种在月经中期的优质宫颈黏液。
3）应该使用妇女月经中期的宫颈黏液。
4）应该在收集精液1个小时内做体外测试，防止失水或温度改变而导致精液质量的变化。
5）宫颈管内宫颈黏液的酸碱度应该用范围为6～10的pH试纸在体内或在收集后立即进行测量。如果是在体内测量酸碱度，应注意采取正确适当的方法进行测量，因为宫颈外的黏液总是比宫颈内黏液的酸碱度要低。不要使酸碱度较低的阴道分泌物污染了宫颈黏液。
6）精子对于宫颈黏液酸碱度变化很敏感。酸性黏液可使精子制动，而碱性黏液可提高其活力。强碱性宫颈黏液（pH＞8．5）会对精子存活产生不利影响。精子能够活动和存活的最适pH值范围为7．0～8．5，这也是月经中期宫颈黏液pH值的正常范围。当pH值在6．0～7．0范围时，精子仍能穿透宫颈黏液，但是在pH值低于6．5时活力会被严重削弱，如宫颈黏液pH值低于7．0时一般无进行检查的必要。
4．5．1．3 体外简化的载玻片试验
（1）步骤
1）将一滴宫颈黏液置于载玻片上，用盖玻片铺平。
2）盖玻片两侧各滴一滴精液使其与盖玻片的边缘接触，借助于毛细作用使精液移向盖玻片下。这样就在宫颈黏液与精液之间形成一个清晰的接触界面。
3）将载玻片水平置于一个37℃湿润的温箱内30分钟，以防止变干。
4）在10×40放大倍数下仔细观察接触面。
（2）观察：观察以下特点是否存在。
1）在几分钟内，精液是否在接触面处形成一些指状突起并伸入黏液。这是一种物理特性，不含有精子的精液也会发生。
2）多数精子在穿透黏液之前先穿过指状突起通道，且多数情况下，单一精子可引导一纵列精子进入黏液。
3）一旦进入宫颈黏液，精子呈扇形散开并随意游动。有些精子返回精浆，但大多数精子继续向宫颈黏液深处游动，直至遇到细胞碎片或白细胞产生的阻力才停止。
4）精子的移动距离至少达到500μm（即大约为10个精子长度）。
5）计数活动精子的百分比率，记录精子是否为直线运动。
（3）结果：因使在玻片上精液－宫颈黏液接触界面的大小和形状完全标准化是不可能的，所以精液－宫颈黏液相互作用仅为定性评估试验。即使如此，该试验结果具有一定的临床价值。
1）正常结果：精子能够穿透黏液且超过90%活动精子为直线运动。(https://www.daowen.com)
2）较差结果：精子能够穿透黏液，但离开精液－黏液接触界面的距离＜500μm，则提示精液－宫颈黏液互作用方面存在问题。
3）异常结果：精子可穿透黏液，但是迅速失活或显示为“抖动”运动，或精液未穿透精液－黏液接触界面；指状突起可以形成，但精子在接触界面的精液侧聚集，提示可能存在抗精子抗体。
4．5．2 精子包被抗体的检测
如果显微镜下观察到精子出现凝集（如活动精子彼此间出现头对头、尾对尾或者头尾混合），提示可能有抗精子抗体存在。抗精子抗体存在时精子并不一定表现为凝集；同样，抗精子抗体存在并不是凝集现象出现的唯一原因。仅有少量抗精子抗体存在也不能作为诊断精子自身免疫疾病的充足依据。只有经过精子－宫颈黏液穿透试验呈现抗体阳性严重地影响精子功能时才能作出上述诊断。
WHO《人类精液检验与处理实验室手册》第五版推荐两种检测精子抗体方法：混合抗球蛋白凝集试验（mixed antiglobulin reaction，MAR）和免疫珠试验（immunobead，IB），免疫珠试验包括直接法和间接法两种。两种检测均有商品试剂盒出售。MAR使用新鲜精液而免疫珠试验使用洗涤后的精液，两种检测方法不一定会得到相同的结果。对于那些没有活动精子或活动精子较少的标本，IB可检测精浆中是否有抗精子抗体存在。尽管IB和MAR的操作过程不太一样，但它们最后都必须使用显微镜观测待测的精子和小珠。小珠与那些表面含有抗体的活动和不动的精子结合，记录被小珠粘住的活动精子占活动精子的百分数。若怀疑精浆可能存在抗精子抗体，可将它稀释后经加热灭活，与经直接法检测证实不含抗体的精子（事先经洗涤除去精浆）共孵育。为了确保结果的可信度，必须使精子与抗体有足够的相互作用时间，至少需要10分钟反应时间才能观察到混合物发生凝集。精子的活动力随反应时间的增长而下降，而检测结果的判读又需要足够的活动精子，因此整个检测过程应控制好时间。
4．5．2．1 混合抗球蛋白凝集试验（MAR）
（1）操作步骤
1）将精液标本充分混匀。
2）重复取出几滴精液（每滴3．5μl），分别置于不同的载玻片上。
3）在另外两张载玻片上分别滴加一滴抗精子抗体（AsAb）阳性精液和一滴AsAb阴性精液（3．5μl）作为每个检测的对照。
4）将3．5μl包被上IgG的胶乳颗粒（小珠）的试剂分别加入待测标本及对照物中，并用加样枪混匀。
5）将3．5μl含有抗IgG的抗血清试剂分别加入待测标本及对照物中，并用加样枪混匀。
6）盖上盖玻片，使悬液保持约20μm的深度。
7）将玻片在湿盒中室温水平放置3分钟，以避免前述悬液被蒸发干。
8）3分钟后，在放大倍数为×200或×400相差显微镜中观察湿片，10分钟后再观察一次。
9）使用IgA的试剂重复上述步骤检测相应的抗体是否存在。
（2）评分：如果精子表面含有抗体，乳胶珠将会黏附在上面。最初，可观察到活动精子带着几颗或者一小簇乳胶颗粒四处游荡。最后，凝集块越来越大，最后精子的活动也因此变得很困难，而没有抗体的精子在颗粒间自由游动。计算被小珠黏附的精子数占总活动精子数的百分率。应注意以下几点：
1）仅计数活动的精子，算出至少被两粒小珠黏附的活动精子数占总活精子数的百分比。不计数尾尖被黏附的情况。
2）为了获得可接受的样本误差，每次至少计数200条活动精子。
3）计算出被黏附的活动精子占总活动精子数的百分率。
4）记录检测抗体的种类及精子被小珠黏附的具体位置（头部、中部和尾部），但忽略尾尖被黏附的情况。
（3）参照值：目前暂时没有正常生育男性精子MAR实验参照值。WHO《人类精液检验与处理实验室手册》第五版将50%活动精子有颗粒附着作为阈值。当50%或更多的活动精子被小珠黏附时，精子穿透宫颈黏液能力和IVF受精率可能受影响。
4．5．2．2 直接免疫珠试验
这项检测比MAR费时，但精子经过洗涤，除去了精浆中可能对检测结果造成影响的物质。在直接免疫珠试验（IB）中，共价连接有兔抗人免疫球蛋白IgG／IgA的小珠与洗过的精子直接混合。活动精子与IgG／IgA小珠黏附在一起提示精子表面含有IgG／IgA抗体。
（1）操作步骤
1）按照试剂说明书制备好精子悬液；
2）将5μl洗过的精子悬液滴加到载玻片上；
3）在另外两张载玻片上分别加入5μl AsAb阳性精子和5μl AsAb阴性精子；
4）向每个精液小滴中加入5μl抗IgG免疫珠悬液；
5）用枪头轻轻地混匀抗IgG免疫珠和精液；
6）将22mm×22mm盖玻片盖在每个小滴上，使每个小滴的深度在20μm左右；
7）将载玻片水平放置于一个湿盒中，在室温下反应3～10分钟；
8）用放大倍数为×200或×400的相差显微镜读片。
（2）评分：同MRA试验。
（3）参考值：WHO《人类精液检验与处理实验室手册》第五版将50%活动精子被黏附作为阈值。当50%或更多的活动精子被颗粒黏附时即可诊断免疫性不育。颗粒与尾尖结合时并不影响生育力，这种情况在生育率正常的男性中也会出现。
4．5．2．3 间接免疫珠试验
间接免疫珠试验被用于检测那些热失活或无精子的体液（血清、睾丸液、精浆或菠萝蛋白酶－溶解的宫颈黏液）。在间接免疫珠试验中，通过使无抗体的供者精子结合上待测体液中的抗精子抗体来达到检测目的。
（1）待测体液的准备
1）待测的体液可以是宫颈黏液、血清、精浆或睾丸液等；
2）按照试剂说明书的要求准备好待测体液。
（2）将供者精子与待测标本共孵育：按照试剂说明书制备好精子悬液，使待测样本中的抗精子抗体结合到精子上。
（3）免疫珠检测
1）使用与待测体液孵育过的供者精子，进行免疫珠（IB）检测。
2）评分和结果解释同上。
4．5．3 抗精子抗体检测的其他方法
除了上述WHO《人类精液检验和处理实验室手册》第五版推荐的检测方法外，抗精子抗体在精液中或其他的体液中存在的检测还有一些其他的方法：凝集试验、制动试验、免疫荧光检测及酶联免疫吸附试验等。
（1）精子凝集试验：精子凝集现象主要与位于精子头部和尾部的两种表面抗原有关。抗精子头部表面抗原的抗体使精子形成精子头－头凝集。精子凝集试验（sperm agglutination test）最好的检测方法是试管玻片凝集法（tube－slide agglutination test，TAT），这种检测方法是在显微镜下检查观察精子的凝集类型。至少10%以上的活动精子有凝集则判断为阳性结果。抗精子尾部表面抗原的抗体测定用明胶凝集试验（gelatin agglutination test，GAT）较好，因为这种精子凝集通常呈大簇状悬浮在明胶溶液中，使用肉眼即能鉴别。虽然这个试验简便易行，但是其主观性很强。
（2）精子制动试验：补体依赖精子制动现象是一种简单的、但能重复的抗精子抗体试验。在补体存在的情况下，与精子抗原相互反应，引起精子膜破坏，其结果造成精子活力丧失，直至精子死亡。这种测试在显微镜下观察，必要时可借助染料染色，染料进入精子后便于观察。抗精子抗体阳性血液中的IgG和IgM具有精子制动活性。具有精子制动活性的血清通常显示有精子凝集活性，相反具有精子凝集活性的血清并不一定具有制动活性。
自从1968报告精子制动试验（sperm immobilization test，SIT）以来，已有许多不同的测试方式，原理上大同小异。有人认为精子制动试验是一种最可靠的测定体液抗精子抗体活性的测定方法，抗精子抗体活性与不育有明显相关性。该方法是检测妇女血清中抗精子抗体的一种筛选方法，但男性不育者的反应滴度很低。
（3）精子免疫荧光检测：间接免疫荧光抗体测定技术理论上说是研究抗精子抗体最合适的方法之一。不育夫妇双方的血清、不育者的精液等都可进行测定。但是该项检查有许多技术问题，其中如荧光的背景、染色的不均匀性，因此约30%精子不能出现典型染色。荧光染料非特异性染色也会对结果造成影响。通常非特异性染色可在精子赤道部、颈部和中间段能见到。精子抗精子抗体存在于精子顶体和尾部，可使精子顶体区出现荧光反应，而精子尾部主段的反应是IgG，精子尾部末端是由于IgM。由于这项检测与精子制动试验及精子凝集试验相关性较差，加上硬件的要求，这项检测未能作为常规检测方法在一般实验室开展。
（4）酶联免疫吸附试验：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是将精子或精子提取物包被于微量反应板后加入待测样品（如血清、精浆和宫颈黏液等），当标本中有抗精子抗体存在时，它立即与反应板上的抗原产生特异性的结合，再加入酶标第二抗体（IgG，IgM，IgA），如加入酶标记的单抗人Ig抗体，就可以通过底物的显色反应来观察结果。因为ELISA是免疫检验中的一个经典的试验方法，具有很多的优点。用ELISA检测抗精子抗体也不例外，其不仅能定性也能定量检测，其检测的标本可以是患者的血清，也可以是精浆或是宫颈黏液等，因此运用此法检测抗精子抗体，在国内已得以大量开展，在不孕不育患者中阳性检出率较高。
4．5．4 精浆免疫抑制物测定
检测精浆中免疫抑制物（male inhibition material，MIM）的方法有：①利用MIM抑制补体C3和B因子活化，抑制抗体参与的补体介导的溶细胞反应抗补体法；②MIM向含有抗MIM血清琼脂板扩散与MIM结合形成肉眼可见的白色沉淀环，通过测量沉淀环直径来判断MIM含量，此法为单向免疫扩散法。
