9．9 吸烟对精子DNA指标的影响
吸烟对精子DNA指标影响的研究在江苏省常熟地区进行，为上海市计划生育科学研究所主持的“中国20～60岁健康男性精液质量与环境影响因素研究”的子项目。
9．9．1 研究对象的基本特征
本部分研究共有合格对象322例，其中吸烟组195例，非吸烟组127例。吸烟和非吸烟对象的年龄分布、户口性质分布、文化程度、职业、人均年收入，以及婚姻状况等的分布均无统计学差异。吸烟组40～45岁组比例略高，为49．74%，而非吸烟组25岁～组比例略高。户口性质均以农村为主，分别为90．26%及88．98%；文化程度以初中为多，分别为60．51%及64．57%；职业以农民为主。吸烟组对象在婚的比例（97．44%）略高于非吸烟组（92．91%）（表9．27）。
表9．27 研究对象的一般人口学特征
吸烟组和非吸烟组相比，对象的性发育和生育状况如是否遗精、是否避孕、性生活是否满意、配偶是否妊娠过，以及遗尿症史等方面亦均无统计学差异（P＞0．05，表9．28）。在322例对象中，有遗精的对象为245例，占的比例为76．09%，吸烟组为79．50%，非吸烟组为76．38%。245例对象的平均首次遗精年龄为16岁，四分位数间距为15～18岁。有320例对象有性生活，占所有对象的99．38%，对象的平均首次性生活年龄为23岁，四分位数间距为21～25岁。在有性生活的对象中，最近3个月平均的性生活次数为5次／月，四分位数间距为3～6次／月；94．38%的有性生活对象使用避孕措施，97．81%的对象对性生活满意，95．31%的对象配偶曾妊娠过。
表9．28 研究对象的性发育和生育史
注：＊表示为Fisher检验P值。
研究对象的生活习惯有所差异，吸烟组饮茶、穿紧身裤的比例均高于不吸烟组。吸烟组家用电器个数4个以下的比例为60．51%，略低于非吸烟者（71．65%）。两组对象经常喝咖啡、可乐，以及坐姿工作，近5年装修房子、有农药接触、使用计算机、使用空调等的比例均无统计学差异（表9．29）。
表9．29 研究对象的生活习惯比较
注：＊表示为Fisher检验P值。
在195例吸烟对象中，吸烟组开始吸烟年龄平均为20岁（四分位数间距为18～21岁），平均每天的吸烟支数为15支（四分位数间距为10～20支／天），平均吸烟年数为19年（四分位数间距为15～22年），平均总吸烟量为91 250支（四分位数间距：62 050～146 000支）（表9．30）。
表9．30 吸烟对象的暴露情况（n＝195）
9．9．2 吸烟对单倍体精子的影响
吸烟组对象的单倍体精子比例平均为92．25%（四分位数间距：90．33%～94．46%），低于非吸烟组（93．45%）（P＝0．004）。饮茶的对象单倍体精子的比例为92．30%（四分位数间距：90．39%～94．51%），略低于不饮茶的对象（中位数：93．17%，四分位数间距：91．10%～95．12%），接近有统计学差异（P＝0．053）。饮酒对象单倍体精子的比例为92．05%（四分位数间距：90．37%～94．13%），也低于不饮酒对象（93．21%）（P＝0．004）。不同家用电器个数组，不同年龄组、不同禁欲时间、不同文化程度和不同职业对象的单倍体精子比例均无统计学差异；也未发现是否接触农药、坐姿工作、使用计算机、空调和手机者的单倍体精子有差别（P＞0．05）（表9．31）。
按该研究检测精液DNA指标的实验室（国家重点实验室）所推荐的正常参考值（单倍体精子比例＞83%），根据单倍体精子数值将研究对象分为正常和异常两组，结果显示：该研究中对象单倍体精子比例异常的百分比非常低，仅为1．24%。进一步分析其在吸烟组中的分布，结果显示：吸烟组单倍体精子比例的异常率为2．05%，而不吸烟组无异常者。精确概率检验没有显示吸烟状况与单倍体精子异常的比例有统计学关联。
表9．31 单倍体精子（%）的影响因素
续 表
按单倍体精子比例的四分位数（P25＝90．67%，P50＝92．7%，P75＝94．69%）为界值，将单倍体精子比例分为四组（＜90．67%组、90．67%～组、92．7%～组，94．69%～组），采用降序拟合logistic回归模型，分析吸烟对单倍体精子的影响。logistic回归分析结果显示：与不吸烟组相比，吸烟组单倍体精子的分布趋向于较高等级的危险性可能降低，OR值为0．55（95% CI：0．37～0．83），也就是说吸烟者的单倍体精子趋向于较低的等级分布，即吸烟可能使单倍体精子降低。调整年龄、农药接触、是否饮茶、电器个数、是否饮酒的多因素非条件logistic回归分析结果与单因素分析的结果一致，OR值为0．63（95%CI：0．41～0．97），仍然提示吸烟可能使单倍体精子降低（表9．32）。
为进一步了解吸烟对单倍体精子比例的影响及其影响程度，对吸烟剂量进行了分组。与精液常规指标的样本含量相比，该部分样本含量较小，故将吸烟年数分为不吸烟（127人）、吸烟＜20年（104人）和≥20年组（91人）；每天吸烟支数分为不吸烟、＜15支（74人）和≥15支（121人）；总吸烟量分为不吸烟、＜10万支（104人）和≥10万支组（91人）。表9．32显示，吸烟20年以下、每天吸烟支数15支以下、总吸烟量10万支以下的对象单倍体精子的分布和不吸烟的对象相比无统计学差异（P＞0．05）；与不吸烟者相比，吸烟年数20年及以上、每天吸烟支数15支及以上和总吸烟量≥10万支的对象单倍体精子趋向于较低的等级分布（均为P＜0．05）；调整年龄组、农药接触、是否饮茶、电器个数、是否饮酒的多因素非条件logistic回归分析结果与单因素分析的结果一致。上述结果提示：吸烟的年数与每天吸烟支数及总吸烟剂量达到一定程度时，可能降低精子中单倍体精子的比例（表9．32）。
表9．32 吸烟对单倍体精子的影响
注：＊调整年龄、农药接触、是否饮茶、电器个数、是否饮酒。
将吸烟年数、每天吸烟支数和总吸烟量这3个变量分别作为等级变量代入logistic回归模型，结果显示单倍体精子的等级分布均随着吸烟量的增大而趋向于较低等级，OR值分别为0．65（95%CI：0．51～0．83），0．67（95%CI：0．54～0．84），0．65（95%CI：0．51～0．83）；调整年龄组、农药接触、是否饮茶、电器个数和是否饮酒后的OR值也均有统计学意义，分别为0．68（95% CI：0．52～0．88），0．72（95%CI：0．57～0．91），0．69（95%CI：0．53～0．89）。上述结果提示：吸烟对单倍体精子的影响存在剂量反应关系，吸烟量越大，单倍体精子的比例可能越低。
9．9．3 吸烟对二倍体细胞的影响
该研究发现：吸烟组的二倍体细胞比例为1．23%，高于不吸烟对象的1．16%（P＝0．008）。不同年龄组、不同文化程度和不同职业对象的二倍体细胞比例均无统计学差异；禁欲时间对二倍体细胞也无明显的影响；是否接触农药和是否使用空调及是否使用手机的对象二倍体细胞的比例也无统计学差异。但饮茶可能对二倍体细胞有一定的影响，有饮茶史的对象二倍体细胞的比例为1．22%，略高于没有饮茶史的对象；饮酒对象二倍体细胞平均为1．26%，也略高于不饮酒对象，非参数检验发现其差异均有统计学意义（P＜0．000 1）。家用电器个数4个及以上的对象二倍体细胞的比例为1．23%，高于家用电器个数＜4个的对象（P＝0．020，表9．33）。
表9．33 二倍体细胞（%）的影响因素分析(https://www.daowen.com)
续 表
按检测实验室推荐的标准，二倍体细胞比例＞3．2%即为异常。该研究对象二倍体细胞比例异常的比例为2．48%。分析其在吸烟对象中的分布，结果显示：吸烟组对象的二倍体细胞比例异常者为4．10%，而不吸烟组的对象异常的比例为0，提示吸烟可能导致二倍体细胞异常比例有上升（P＝0．024）。
按实验室推荐的标准，二倍体细胞异常的比例很低，将二倍体细胞在精子细胞中所占的比例按四分位数（P25，P50，P75）分组，拟合logistic回归模型，以了解吸烟对二倍体精子的比例是否有影响及其影响程度。与不吸烟者相比，吸烟组二倍体细胞的比例趋向于较高等级，OR值为1．99（95%CI：1．32～2．98）。调整年龄、农药接触、是否饮茶、电器个数及是否饮酒后logistic回归分析结果仍显示吸烟增加二倍体细胞的比例，OR值为1．67，95%CI为1．08～2．57。将吸烟年数、每天吸烟支数、总吸烟量按不同的剂量分组，与不吸烟组进行比较，单因素分析结果显示：吸烟＜20年和20年及以上的对象、总吸烟量＜10万支和10万支及以上的对象二倍体细胞的等级分布均趋向于较高的等级；但调整年龄组、农药接触、是否饮茶、家用电器个数和是否饮酒因素后，仅吸烟20年及以上的对象、总吸烟量10万支及以上的对象二倍体细胞比例趋于较高（P＜0．05）。对不同每天吸烟支数组的比较发现，无论调整其他可能的影响因素与否，与不吸烟者相比，每天吸烟15支及以上的对象二倍体细胞的比例有统计学意义的升高，即二倍体细胞的比例增加（表9．34）。
表9．34 吸烟对二倍体细胞的影响
注：＊调整年龄、农药接触、是否饮茶、电器个数、是否饮酒。
将吸烟年数、每天吸烟支数和总吸烟量这3个变量以等级变量代入logistic回归模型，结果提示二倍体细胞的等级分布和吸烟相关指标（吸烟年数、每天吸烟支数、总吸烟量）之间可能存在剂量反应关系。吸烟年数、每天吸烟支数，以及总吸烟量的二倍体细胞比例OR值分别为1．52（95%CI：1．19～1．94），1．55（95%CI：1．23～1．94），1．60（95%CI：1．25～2．04）。在校正年龄、农药接触、是否饮茶、电器个数、是否饮酒因素后，仍均有统计学意义，OR值分别为1．46（95%CI：1．12～1．91），1．40（95%CI：1．10～1．78）和1．49（95%CI：1．15～1．93），上述结果呈现为吸烟使二倍体细胞比例增加，且吸烟年数越长、每天吸烟支数越多或总的吸烟量越高，精液中的二倍体细胞的比例越高。
9．9．4 吸烟对大于二倍体细胞的影响
吸烟组精液中大于二倍体细胞的比例为1．12%，高于不吸烟的对象（P＜0．000 1）。单因素非参数检验结果显示：还发现是否饮茶组对象的大于二倍体细胞比例有所不同，有饮茶史的对象大于二倍体细胞的比例为1．10%，高于没有饮茶史的对象（P＝0．007）；饮酒者大于二倍体细胞的比例为1．22，也高于不饮酒者，非参数检验均有统计学意义（P＜0．000 1）。家用电器个数4个及以上的对象大于二倍体细胞的比例高于家用电器个数4个以下的对象（P＝0．020）。研究没有发现不同年龄组、不同禁欲时间、不同文化程度、不同职业及是否使用手机的对象精液中大于二倍体细胞的比例有统计学差异，也没有发现接触农药、坐姿工作和使用空调对大于二倍体细胞比例有影响（表9．35）。
表9．35 大于二倍体细胞的影响因素分析
续 表
大于二倍体细胞也是精子细胞中非正常者，其比例应该是越低越好。该研究检测实验室的推荐标准为其比例应不高于3．1%，若高于3．1%即为异常。该研究对象大于二倍体细胞比例异常的百分比为0．93%，可视为基本正常。
同对单倍体、二倍体的分析方法一样，该研究也将大于二倍体细胞的百分比按P25（0．70%），P50（1．06%）和P75（1．32%）分为4个等级，拟合有序多分类logistic回归模型，分析吸烟对大于二倍体细胞的影响。从表9．36中可以看出，吸烟组大于二倍体细胞的分布趋向于较高的等级，OR值为2．43（95%CI：1．61～3．66）。调整年龄、农药接触、饮茶、电器个数、是否饮酒后的logistic回归分析结果，OR值为1．85（95%CI：1．20～2．86），提示吸烟可能增加大于二倍体细胞的比例。
为探讨吸烟对大于二倍体细胞的影响以及可能的剂量反应关系，将吸烟年数、每天吸烟支数、总吸烟量按不同的剂量分组，与不吸烟组比较大于二倍体细胞的分布是否有所不同。单因素logistic回归的结果显示：吸烟年数越长、每天吸烟支数越多和总吸烟量越大的对象大于二倍体细胞的分布均趋于较高等级。在调整了年龄、农药接触、是否饮茶、电器个数和是否饮酒后，与不吸烟组的对象相比，吸烟≥20年、总吸烟量≥10万支的对象大于二倍体细胞的分布仍趋向于较高等级，OR值分别为2．61（95%CI：1．51～4．51）、2．22（95%CI：1．32～3．74）。每天吸烟＜15支的对象的OR值为1．82（95%CI：1．06～3．14），每天吸烟≥15支的对象的OR值为1．87（95%CI：1．16～3．03，表9．36）。
表9．36 吸烟对大于二倍体细胞的影响
注：＊调整年龄、农药接触、是否饮茶、电器个数、是否饮酒。
将吸烟年数、每天吸烟支数、总吸烟量分别作为等级变量，拟合单因素logistic回归模型，吸烟年数、每天吸烟支数和总吸烟量对大于二倍体细胞的影响均存在剂量反应关系。吸烟年数的OR值为1．79（95%CI：1．40～2．29），每天吸烟支数的OR值为1．60（95% CI：1．28～2．01），总吸烟量的OR值为1．74（95%CI：1．36～2．23）；在调整年龄、农药接触、饮茶、电器个数和饮酒因素后也均有统计学意义，吸烟年数、每天吸烟支数及总吸烟量的OR值分别为1．60（95%CI：1．22～2．10）、1．36（95%CI：1．07～1．73）、1．49（95% CI：1．15～1．94）（未列表），提示吸烟可能增加精液中大于二倍体细胞的百分比，且存在剂量反应关系。
9．9．5 国内外研究进展
吸烟不仅可能影响精液常规指标，使精子的数量减少和活动率降低、畸形精子的发生率增多，还可能直接损害精子，导致精子DNA、染色体以及其他相关指标的改变；吸烟还可能影响生殖细胞的成熟和增殖，导致精子发生突变［22，49］。烟草浓聚物及其代谢产物中富含致突变和致癌物质，这些物质可通过血－生殖腺屏障，使调节精子生成的遗传物质（核糖核酸和蛋白质）合成受阻，从而影响精子的产生包括精细胞数量的增多和繁殖细胞的分化成熟，引起精子DNA突变及畸形精子增加。赵景春等［50］将昆明种小鼠随机分组，分别以4．7g／m3，9．4g／m3和18．8g／m3的香烟烟雾染毒，结果雄性小鼠的早期精细胞微核畸变率、精原细胞染色体畸变率和精子畸形率都随被动吸烟的浓度而上升，且呈正相关。
国外在健康男性和不育人群开展了大量相关实验室研究，结果表明吸烟可能增加精子DNA的氧化损伤，导致DNA断裂、碎片增加，影响DNA的完整性。Fraga等［19］对加利福尼亚和阿根廷健康男性的研究也显示：与不吸烟者相比，吸烟者精液DNA中的8－OhdG较不吸烟者增加50%（8－OhdG为DNA氧化损伤后的一种产物，为人类精液DNA氧化损伤的标志物），吸烟者为10．2mol／mg DNA，不吸烟者为6．7mol／mg DNA（P＝0．005），而且吸烟者α－生育酚（维生素E）的浓度下降32%（P＝0．03）。Shen等［20］也研究发现：吸烟者精子DNA中的8－OHdG含量明显高于不吸烟者，分别为6．19 8－OHdG／105 dG和3．93 8－OHdG／105 dG（P＜0．001），而且精液中8－OHdG含量与可替宁（尼古丁的主要代谢产物）的含量密切相关（r＝0．38，P＜0．05）。Sepaniak等［39］对法国的不孕不育咨询人群研究发现（不吸烟组57例、吸烟组51例），吸烟者DNA碎片的比例高于不吸烟者（32%Vs．25．9%，P＜0．01），但是两组常规指标之间差异无统计学显著性，且DNA碎片的量与常规指标间也没有统计学关联，这提示吸烟可能损伤精子核和精子DNA，因此他认为在不孕治疗中，应把吸烟作为一个独立参数进行诊断和评估。Horak等［51］募集了86名健康志愿者和93名有生育力损害者，分析了他们精子中大DNA加合物的水平，结果显示：所有对象一起统计，吸烟者大DNA加合物水平是不吸烟者的2．2倍（P＝0．054），在健康志愿者中，现吸烟者精子中大DNA加合物的水平是非吸烟者的2．7倍（P＝0．008）；且生育力损害者中大DNA加合物水平与精子密度、活力呈负相关（P＝0．008）。Zenzes等［52］的研究显示：吸烟者中SIS分数（staining intensity score）、可替宁与吸烟量密切相关，且吸烟者精子BPDE－DNA加合物的含量也增加，但在非吸烟者的浓度也不低（表示环境中本底浓度较高，图9．2）。
图9．2 BPDE－DNA加合物含量指标、SIS分数与精浆可替尼含量的散点图［52］
国内学者对吸烟与精子DNA、染色体的关系也开展了相关研究，同样也发现吸烟可致人精子DNA损伤、单倍染色体畸变率增高。张海珠等［53］对23例吸烟5～14年的男性及23例无吸烟史的正常男性的分析，结果显示：不吸烟组精子染色体畸变率为4．13%，吸烟组为7．32%（P＜0．05）。张昌军等［13］对37名有生育能力、无酗酒史的健康男性研究，结果发现：不吸烟者精子染色体结构畸变率为4．05%，轻度吸烟者为（日均20支）8．31%，而重度吸烟者（日均40支）高达13．83%（P＜0．01）。刘俊茹等［40］研究了191例不育男性，发现吸烟组精子DNA完整率异常比例显著高于不吸烟组，且精子DNA完整率异常组精子密度显著低于精子DNA完整率正常组。牛志宏等［31］选择上海786例不育患者的进行精液分析发现：日吸烟量≥20支或吸烟≥10年的男性DNA损伤指数（DFI）和不成熟精子指数（以高着色性表示，HDS）均升高（P＜0．05）；DFI与HDS均与精子畸形率呈正相关（r＝0．31与r＝0．39，P均＜0．05）。李芃等［54］对383例沈阳地区不育患者研究显示：日吸烟量≥20支的对象精子DNA碎片率为40．7%，明显高于日吸烟量＜20支和不吸烟的对象（分别为27．3%和22．5%），但两组差异无显著性。
此外还有研究表明：吸烟可能增加DNA的脆弱性。Potts等［55］的研究发现：与不吸烟组相比，吸烟组对象的精液中DNA的一些变化对酸更加敏感，包括变性的温度、突变的比例等。吸烟组DNA变性的温度为50．1℃，接受酸处理后变性温度为27．9℃；不吸烟组DNA变性温度为52．0℃，接受酸处理后变性温度为39．8℃。因此，他们认为烟草所含的致突变物和致癌物质可使精子对酸性诱变剂的敏感性增高，精子DNA链断裂增加，导致畸形精子增多。
吸烟不仅可以损伤精子DNA，且可能影响有丝分裂，导致精子染色体出现异常，产生非整倍体精子。Rubes等［29］对美国青少年的研究显示（10例每天吸烟≥20支，超过2年以上，且又喝酒；15例不吸烟）：吸烟者发生非整倍体的可能性大于不吸烟组（两组相比Y染色体发生二倍体的差异，P＜0．001；X染色体、Y染色体和第8条染色体发生二倍体的差异，P＜0．01）。Harkonen等［56］对丹麦的杀虫剂接触农民进行研究，采用Possion分析显示：吸烟者三倍体精子发生的概率大于不吸烟者（杀虫剂使用前，P＝0．02，杀虫剂使用后P＝0．06）；吸烟也增加二倍体精子的机会（使用前P＝0．03，使用后P＝0．04），也与多倍体的发生存在相关性（使用前P＝0．008，使用后P＝0．03），因此，认为吸烟可以增加男性非整倍体综合征的危险性。Perreault等［57］对环境污染物（多环芳烃）与精子遗传物质关系的研究显示：污染重的冬天（1994）吸烟者发生YY－8染色体异常精子的频数是4．5次／万精子，而非吸烟者为2．2次／万；且环境污染更重的冬天（1993）非吸烟者异常精子的频数为3．5次／1万，而污染较轻的夏末（1993）非吸烟者精子0．6次／万。作者的研究也发现：吸烟年数越长、每天吸烟支数越多或总的吸烟量越高，精液中的二倍体精子、大于二倍体精子的比例越高，单倍体精子的比例越低，存在一定的剂量反应关系。
虽然多数研究认为吸烟对精子DNA有负面影响，但也有研究并未发现吸烟与精子DNA存在相关性。Oldereid［36］等对350例进行生育检查的男性检测了精液常规指标，并采用流式细胞术分析精子DNA水平。结果显示：非吸烟者、中度吸烟者（1～14支／天）和重度吸烟者（15～40支／天）的精液常规指标和DNA指标均没有明显的差异。Vine等［58］对86名健康志愿者的研究显示：吸烟、喝咖啡、饮酒等生活方式对精子的核大小、形态、染色质结构没有显著影响。Sergerie等［28］将97名加拿大健康志愿者分为不吸烟组、轻度吸烟组和重度吸烟组，结果发现不吸烟、中度、重度吸烟组精子DNA碎片的比例中位数分别为12．11%，11．66%和20．41%，差别没有统计学意义。重度吸烟组血液和精液中可替宁和镉的含量较高，且精子DNA碎片与血镉、精液中镉、精浆中可替宁等的含量的关系没有统计学意义，仅与血浆中可替宁含量有较弱的负相关（r＝－0．240，P＜0．05）。但该研究轻度、重度吸烟组样本量分别为17例、11例，可能略显不足。
总体上，尽管在一些研究并未显示精子DNA或染色体异常与吸烟的关系，吸烟可造成精子DNA损伤，或染色体畸变的观点已被广泛认可。精子DNA的完整性是正确传递遗传信息所必须，精子DNA的损伤或染色体的异常可导致男性不育，或不良妊娠结局。赵景春等［50］动物实验显示：高、中剂量染毒组的雌性小鼠的胎鼠存活率下降，死胎增加。宋岳强等［59］对2 431例闽南地区的优生检查的男性研究显示：吸烟组配偶自然流产率34．3%，不吸烟组为29．6%（P＜0．05）；按吸烟量分析，每天吸烟超过20支的对象，配偶自然流产率最高达37．3%，明显高于不吸烟组和每天吸烟少于20支的对象（P＞0．01）。吸烟可能通过多种途径导致动物和人类的生殖细胞遗传物质受损，影响精子DNA的各种指标，而不同的精液指标对烟草的敏感程度也是不同的，因此精子DNA损伤分析可能比传统精液指标更敏感地预测男性生育能力。
