免疫和分子生物学诊断技术
免疫和分子诊断在寄生虫病或寄生虫感染的诊断和鉴别诊断中具有非常重要的意义。分子生物学的诊断方法还是检测寄生虫混合感染和亚临床感染病例的最有效的方法。而免疫学的方法可以在体内外应用抗原检测患者体内的抗体或者应用抗体检测患者体内的循环抗原，可以特异、敏感诊断寄生虫病或者感染，不仅可以让患者得到及时的治疗，而且还可以避免药物的滥用，对于及时、合理治疗寄生虫病是必不可少的，也是进行寄生虫病防治的关键。同时，随着现代医学技术的发展和各种新兴技术的发展，与免疫学方法相互结合，使这些免疫学方法更为敏感、快速、高通量。例如，一种基于免疫反应原理的快速生物分析技术——微流控芯片技术，就是由样品富集及免疫分析模块和信号采集模块及对芯片的系统控制组成。这样的芯片可以应用于检验患者被检样品中的病原体或其抗体为目的的临床快速检测。整个检测系统具有的优点，就是微流控芯片用于操作微小网络通道（5～500μm）中流体，传输微升至毫微升量级的流体，许多分析过程可以在数分钟内完成，缩短反应时间，提高分析效率；节约试剂和样本，使微流控芯片在寄生虫病的诊断方面表现出巨大的应用潜力。还有将一种抗寄生虫的特异性抗体用胶体金或者胶体硒标记，这种抗体可与血液标本中的寄生虫抗原相结合形成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物在层析过程中可以被另一种固定在硝酸纤维素膜上的抗寄生虫的特异性抗体捕获，从而在膜上出现肉眼可见的沉淀带。这样可以在30min以内获得结果。另外，应用基于蛋白质组学的病原体筛查和确认技术、基于蛋基因组学的病原体整合芯片测定技术、基于核酸扩增质谱法的病原体检测技术都可以应用到寄生虫病或感染的诊断和鉴别诊断。但是，这一些新技术、新方法的应用也与相应寄生虫的基因组测序的完成与否、高度保守基因存在、基因的拷贝数、同源性的多少和寄生虫生活史不同时期基因表达的不同有关。基因检测和质谱分析对寄生虫虫种的鉴定、基因分型和确定抗药基因的存在与否是其他诊断方法不可比拟的。
一般而言，免疫学方法包括检测患者体内病原体的抗原和检测患者体内抗相应病原体的抗体。尽管方法相当多，但是基本的原理往往类似。
1.间接荧光抗体技术（indirect fluorescent antibody technique，IFA） 以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术，而间接荧光抗体技术用荧光抗体示踪或检查相应抗原的抗体。以荧光色素标记抗体球蛋白结合，标记抗体再与患者血清中相应抗体结合用于检测或定位各种抗原。例如，以间接荧光抗体技术来确诊患者是否感染利什曼原虫、弓形虫、溶组织内阿米巴、巴贝虫、疟原虫等。而且根据IgM和IgG升高的变化可以判断急性或亚急性感染。该方法的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快；可以根据血清的稀释度来判断感染的程度。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定受主观性影响。随着患者病情的好转，血清的效价逐渐可下降至正常。
2.酶联免疫吸附测定法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA） ELISA是一种特殊的试剂分析方法，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。其可以测定患者血清中的病原体的抗体也可以检测患者排泄物、分泌物、脑脊液中的病原体抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的保留其免疫活性抗原或抗体；②保留其原免疫活性与酶活性的酶标记的抗原或抗体（标记物）；③酶作用的底物，即是显色剂。在检测时需要决定抗原的性质。例如，天然抗原或者重组抗原，糖蛋白还是限速酶，是膜抗原还是细胞质抗原等，因为抗不同抗原抗体的抗体效价、持续时间和临床意义各不相同。最终反应所生成的颜色深浅与需要测试的抗原（抗体）含量呈正比。这种有色产物可用分光光度计（酶标仪）测定、肉眼可以观察、光学显微镜也可以观察。其方法简单、快速、特异性好，在检测中可以应用血清、脑脊液检测抗体和粪便、脑脊液和新鲜血清检测抗原，应用范围非常广泛几乎可以覆盖所有的寄生虫感染。目前商品化的试剂盒大多属于ELISA检测方法。
3.斑点印迹法（dot－blot） 该方法有类似ELISA的原理，将抗原样品固相化在醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜上对抗原固定化基质膜进行抗体的检测和分析。抗原可以是纯化的天然抗原，纯化的重组蛋白，用于检测患者血清相应抗体的反应性，最后进行酶作用的底物显色。其方法简单，快速，检测不需要特殊的设备，如果抗原的特异性好，就可以达到高敏感和特异的水平。可检测血清、脑脊液中特异性的抗体。可以应用于血吸虫病、肝吸虫病、肺吸虫病、棘球蚴病、部分原虫病等的诊断和鉴别诊断。
4.免疫印迹法（Western blot） 免疫印迹法又称蛋白质印迹法，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体［硝酸纤维素薄膜或者聚偏氟乙烯（PVDF）膜］上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知的蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对一些新发现的基因产物，也可通过重组蛋白的抗体进行检测。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。这个方法尽管特异性好，但是操作费时费力，一般不在临床检验科使用，但是对各种寄生虫蛋白的表达和诊断的研究非常重要。
分子生物学的诊断方法是检测寄生虫感染最有效的方法，所以分子诊断方法是控制寄生虫病和发现亚临床感染病例的重要手段，可以避免误诊。以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的基因扩增方法均可以应用，核酸探针杂交和基因芯片等均以其特异性强、敏感性高的优点而可以应用于寄生虫病或感染的诊断。
5.聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 应用PCR和PCR产物测序可以特异和敏感地检测寄生虫的基因，尤其是寄生原虫的基因扩增，这已经成为分析研究寄生虫多样性的理想的工具。选择合适的PCR基因分型的策略，例如选择基因标志、基因的扩增效率、不同寄生虫种株的兼容性等。一般而言，作为基因标志的任何多态性序列应该有以下特征：①这段基因在该寄生虫的基因组中必须是单拷贝的；②不同虫种株均存在这一可变区，自然情况下不能存在无效变异；③具有稳定的多态性序列，将多态性序列作为基因标志则应考虑在该种群的多态性程度和这种变异的容易鉴别程度。在一些情况下，可以出现两种或多种的重复序列，其重复的次数和排列可以作为不同种株间的特征。由于大多数等位基因的变化可以简单地以电泳图上片段的大小进行区分，所以重复序列而导致的多态性可以成为基因分型最为适宜的标志。
在进行标本收集、DNA提取和基因扩增的过程中，有许多细小却重要的问题需要注意。在PCR扩增时注意所谓抑制剂的存在；在扩增靶基因时有两个主要的问题可能影响到PCR的效率：①模板DNA的质量、试剂的质量或一些人为的因素；②人为的污染，也许是DNA或试剂的交叉污染或是在进行巢式PCR时的污染等。
靶基因扩增PCR法具有敏感性高、特异性强、快速等优点，整个反应过程是在PCR仪上自动进行。除了常规PCR，尚有巢式PCR（nested PCR）、复合PCR（multiplex PCR）等多种PCR技术用于寄生虫感染的诊断。理论上说，只要标本中存在几个拷贝的寄生虫基因就可通过基因扩增出特异的DNA序列。PCR方法还是目前一致公认的敏感性及特异性好的诊断方法。但是PCR检测寄生虫需要PCR扩增仪、高速离心机、电泳仪、凝胶成像系统等设备。对比起病原学检测而言结合患者体液或血液中的病原体DNA来进行PCR诊断寄生虫病具有很大的潜力。
6.实时定量聚合酶链反应法（quantitative real－time PCR，qPCR） 分子技术检测特异性的寄生虫核酸序列可以检测到非常低含量的病原体核酸。qPCR具有快速、低污染风险、高敏感性和特异性的特点。这些特性决定了其不仅具有诊断和临床检测的价值，而且具有流行病学调查、疾病控制和疾病监测的作用。例如，在流行区系统性的回顾性调查中应用了血涂片疟原虫病原检测和PCR技术，应用血涂片病原检测的感染率情况仅仅是PCR检测的50.8％，说明PCR比血涂片病原检测更优越。其实，Real－time PCR不仅可以在低寄生虫血症时可以明确诊断，而且在不同虫种、虫株间的鉴定也有重要作用。分子生物学的方法则可以及时给以治疗。应用Real－time PCR FRET探针根据不同的熔解温度来区分恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫；再以特异的FRET探针来检测诺氏疟原虫，建立了在一个系统应用2套引物以检测5种不同的疟原虫体系，所以应用Real－time PCR诊断疟疾在流行区是有效和敏感的方法。
一些改良的PCR方法包括巢式PCR、复合PCR、Real－time PCR等可以作为二线的诊断方法应用于传统方法难以确诊的疾病。PCR方法也具有一些限制的因素。例如，方法比较综合、检测的成本比较高、需要培训操作人员等。另外，PCR方法的质控问题和设备保养问题，PCR方法在操作上的复杂性和实验资源上的问题，其在基层仍然不是临床常规的方法。
7.环介导等温扩增技术（loop－mediated－isothermal－amplification，LAMP） LAMP技术是近年来发展的一种灵敏、特异、快速的新型基因检测与核酸扩增技术。与传统的PCR方法相比，LAMP不需要热循环，为等温扩增，其检测结果可以通过加入核酸染料SYBR GREEN进行肉眼观察或使用浊度计即可进行判定。因此，LAMP是一种不需要热循环仪，肉眼即可判定结果的高度特异性和敏感的DNA扩增技术，所以更适用于现场、基层条件较差的实验室进行快速检测。LAMP技术是一种简单经济、特异和灵敏的快速基因检测技术，可以检测寄生虫保守的18SrRNA基因等，而其敏感性和特异性与巢式PCR相似，所需时间明显缩短。一些实验显示，在寄生虫感染的诊断过程中相比巢式RT－PCR，RT－LAMP具有更高的敏感性和相似的特异性，而且节约分析时间。其仅仅需要非常基础的仪器，容易观察结果，操作简单可以应用于流行病研究。所以LAMP是寄生虫病常规诊断的更可靠和有用的方法。由于实验试剂需要冷藏，所以LAMP在寄生虫感染的临床诊断上的可行性和权威性有待进一步确认。
8.微阵列芯片 随着多种寄生虫基因组测序的完成给寄生虫病的诊断提供许多的机会，微阵列分析将在寄生虫病、热带病的诊断中起着重要的作用。微阵列分析的工作原理是传统上的Southern印迹杂交。以高密度阵列为特征，微阵列分为cDNA微阵列和寡聚核苷酸微阵列，微阵列上“印”有大量已知部分序列的DNA探针。探针的种类有基因组DNA探针，重复序列DNA探针，寡核苷酸探针及RNA探针等。所获结果因探针种类和不同的样本处理方法而缺乏均一性。探针放射性核素半衰期短，存在污染环境等问题。其后，以生物素或地高辛配基标记探针，但敏感性又有所下降。由于微阵列技术就是利用分子杂交原理，使同时被比较的标本与微阵列杂交，通过检测杂交信号强度及数据处理，把它们转化成不同标本中特异基因的丰度，从而全面比较不同标本的基因表达水平的差异。
（程训佳）