药物卫生微生物检验
根据给药途径及使用要求不同，可将药物制剂分为两种类型，即规定灭菌制剂和非规定灭菌制剂。灭菌制剂（如各种注射剂、输液剂、供角膜创伤及手术用的眼药制剂、植入剂、可吸收的止血剂、外科用敷料和器材等）是直接进入血液、肌肉、皮下组织或接触创伤、溃疡等部位发挥作用的药品或要求灭菌的材料、器具等，必须保证不含活的微生物，否则将导致严重后果。为此，规定灭菌制剂制成后须进行严格的无菌检查，证明绝对无菌才为合格。非规定灭菌制剂包括口服药、外用药及其辅料等，虽不必要求达到无菌状态，但为保证质量和使用安全，对其染菌数量和种类也有限制。
药物卫生微生物检验项目主要包括灭菌制剂的无菌检验和非规定灭菌制剂的微生物限度检查。
（一）灭菌制剂的无菌检验
无菌检验的基本原理是以无菌操作方法，将被检药品分别接种于适合需氧菌、厌氧菌、真菌生长的液体培养基中，置于适宜温度下培养一定时间，观察有无微生物生长，以判断药品是否合格。因此，灭菌制剂的无菌检验内容就是需氧菌、厌氧菌及真菌的培养检查。
1.无菌检验的基本原则
（1）严格进行无菌操作：无菌检验的全部过程都必须严格遵守无菌操作，在洁净度100级单向流空气区域内，防止因微生物污染而影响检验结果。
（2）正确进行样品采集：无菌检验是根据对整体中部分样品的检查结果，来推断整体的无菌或染菌情况。在对一批药品做无菌检验时，取样数量越少，检出染菌的概率越小；取样越多，检出染菌的概率越大，检查结果越能反应该批药物的真实情况。因此，无菌检验时采样数量和比例必须按药典的规定进行。出厂药品检验量和上市抽验药品检验量如表41-1、表41-2。
表41-1 出厂药品检验量
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表41-2 上市抽验药品检验量
2.灭菌制剂的无菌检验方法
（1）一般灭菌制剂的无菌检验：通常采用直接接种法。若被检品是液体，可直接接种于培养基内；若被检品是固体粉剂或冻干制剂，则需先用无菌生理盐水溶解，或制成均匀悬液，再接种于培养基内（表41-3）。被检药品无菌检验的同时，还须做相应的阴性、阳性培养对照试验。我国药典规定，以金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、生孢梭状芽孢杆菌CMCC（B）64941、白色假丝酵母菌CMCC（F）98001分别作为需氧菌、厌氧菌及真菌培养的对照菌。
表41-3 无菌检验用培养基种类、数量及培养温度和时间
（2）油剂的无菌检验：油剂药物与液体培养基不能混溶，常因漂浮于培养基表面而影响试验结果。检验这类药物时，应先在培养基中加入表面活性剂（如吐温-80），使药物能够均匀分布于培养基中，以利于微生物的生长。若药物的黏稠度过大，可先用灭菌植物油或灭菌液状石蜡稀释，再接种于含表面活性剂的培养基中。
（3）抗菌药物及含防腐剂药物的无菌检验：抗菌药物是本身为抗菌剂（如抗生素、磺胺药等）或其中含有部分抗菌剂的药物。由于抗菌剂、防腐剂有杀菌、抑菌作用，可影响无菌检验结果的正确判断，故接种前必须采取必要方法使抗菌剂、防腐剂消除或失效。常用方法如下。
1）灭活法：在培养基中加入合适的灭活剂，此灭活剂本身以及与抗菌药物作用后的产物对细菌和霉菌没有毒性。常用灭活剂（表41-4）。
表41-4 部分抗菌药物的灭活剂
2）微孔滤膜过滤法：将供试药物通过孔径为0.22～0.45μm的灭菌微孔滤膜，用生理盐水洗涤抽滤滤膜几次，以除去抗菌剂或防腐剂；然后将滤膜剪成若干片，在严格的无菌操作条件下，放入培养基中进行检验。
3.无菌检查结果判定 阴性对照应无菌生长，说明培养基本身是无菌的；阳性对照管试验必须长菌，说明应用的对照菌在该试验条件下能正常生长，其试验结果是准确、可靠的。
当阳性对照管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据待检品的结果进行判定。
如需氧菌、厌氧菌及真菌培养基为澄清均应判为供试品合格。
如需氧菌、厌氧菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为待检试品不合格。
如为抗生素类药物，无论细菌或霉菌，培养时间均为7天，放射性药物则为8～14天，无菌生长才为合格。
（二）非规定灭菌制剂的微生物限度检查
非规定灭菌制剂包括各种口服制剂、一般外用药、中草药。非规定灭菌制剂及其原料、辅料一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有病原菌存在。非规定灭菌制剂的微生物限度检查包括数量和种类的限度检查，其检查项目是：
（1）染菌量检查：包括细菌数、霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。
（2）控制菌检查：我国药典规定控制菌检查包括大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、破伤风梭菌检查和活螨的检验。药物种类、给药途径、医疗目的不同，药典规定的药品染菌数量和控制菌种类的检查有所不同。
并规定口服药物每克或每毫升中不得含有大肠埃希菌、沙门菌；外用药物每克或每毫升中不得含有铜绿假单胞菌、破伤风梭菌、金黄色葡萄球菌。并要求均不得检出活螨。
1.微生物限度检查的基本原则
（1）为使检验结果具有代表性，被检药物的采样应有一定数量。一般每个批号的药物至少随机抽样2瓶（盒）以上。从各瓶（盒）被检药物中的采样量不得少于10 g或10 mL，蜜丸应采4丸以上共10 g。贵重或微量包装的药物采样量可酌减。
（2）药物在检验前，应保持原包装状态，不得开启，以免污染。药物应放置阴凉干燥处，防止微生物繁殖而影响检验结果。
（3）检验的全部过程应严格无菌操作。被检药物一旦稀释后，必须在1～2小时内操作完毕，以防微生物继续繁殖或死亡。
（4）为排除药物中所含防腐剂或抑菌成分对试验结果的干扰，应同时利用已知阳性对照菌设立阳性对照。
细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度检查项目规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合者，应判供试品不合格。
2.染菌数量的检查 分别测定单位重量或体积（克或毫升）的被检药物中所含活的细菌总数（实际是活的需氧菌数量）、霉菌和酵母菌总数。一般而言，染菌量越多，药物受致病菌污染的可能性越大。
（1）细菌、霉菌与酵母菌总数的测定方法：均采用倾注平皿培养计数法，即取一定量的被检药物，将其稀释成不同浓度的稀释液（如1∶10、1∶100、1∶1 000……），吸取不同稀释度的药液各1 mL，分别注入无菌平皿中（每一浓度的稀释液做2～3个平皿），然后倾注适量培养基，混匀凝固后，放适宜温度的培养箱中培养至规定时间（细菌总数测定放35℃培养48小时、霉菌与酵母菌总数测定放25～28℃培养72小时）。
检验所用培养基应适合待测微生物的生长繁殖。《中国药典》（现行版）规定：营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数，酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。合剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，分别测定霉菌、酵母菌菌落，合并计数。液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基，同时计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。
（2）菌落总数测定结果及计数方法：经过适宜条件培养后统计培养基上生长的菌落数。一般选取菌落数在30～300个（霉菌菌落计数一般选取菌落数在5～50个）的平板进行计数，然后乘以稀释倍数即得每克或每毫升待检药物中的菌落总数，如超过规定的限量则认为不合格。
为了确保药品在整个生产、保存和使用过程中的质量，制定一个合理的药品微生物限度标准是十分重要的。《中国药典》（现行版）按不同剂型制定了药品的微生物限度标准（表41-5）。
表41-5 部分制剂微生物限度标准（单位：个/g或mL）
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注：①“—”为1 g或1 mL中不得检出。②含动物组织来源的制剂（包括提取物）还不得检出沙门菌。③抗细菌的口服抗生素制剂应检查霉菌，每1 g中不得过100个。④抗真菌的口服抗生素制剂应检查细菌，每1 g中不得过100个。⑤创伤、溃疡、止血、深部组织及阴道用含原药材粉的制剂，还不得检出破伤风梭菌。⑥发霉、长螨者，以不合格论。
3.控制菌检查 在药品中不能检出的控制菌根据不同类型的药物制剂，要求不得检出的控制菌也不同。
控制菌检验的原则：控制菌的形态和培养特征的观察是鉴别的基本要求，对生化反应、血清学反应、动物毒力试验等项目的要求因菌而异，各有其侧重点。(https://www.daowen.com)
控制菌检验的基本程序：根据各种控制菌的生物学特性来进行鉴定，其检查的基本程序为，药物的准备或预处理→增菌培养→分离培养→染色镜检→生化试验、血清学试验、动物试验等→控制菌鉴定→卫生评价。
（1）大肠埃希菌的检验 大肠埃希菌是口服药品的常规必检项目之一。药品中的大肠埃希菌来源于人和温血动物的粪便。凡由检品中检出大肠埃希菌时，表明该药品可能被粪便污染，患者服用后，有被粪便中可能存在的其他肠道致病菌和寄生虫卵等病原体感染的危险。因此，口服药品中不得检出大肠埃希菌。
1）增菌培养：目的是使被检药物中的大肠埃希菌增殖，从而避免漏检。方法是取适量被检药液，接种于胆盐乳糖增菌液中进行培养。
2）分离培养：目的是从混有杂菌的增菌培养物中分离出大肠埃希菌。方法是将增菌培养物接种于肠道选择性平板上，经培养后，大肠埃希菌呈乳糖发酵型有色菌落。
3）染色镜检：挑可疑菌落作革兰染色镜检，大肠埃希菌应呈革兰阴性短小无芽孢杆菌。
4）生化反应：主要目的是与产气肠杆菌区别，因为两者的形态、染色性、培养特征等非常相似，但产气肠杆菌广泛分布于自然界，无卫生学意义。利用IMViC试验可将两者区别。
大肠埃希菌的主要鉴定依据是：①革兰阴性短小无芽孢杆菌；②在麦康凯琼脂培养基上菌落为红色、在伊红亚甲蓝琼脂上菌落为紫黑色，并有金属光泽；③分解乳糖产酸产气，IMViC试验结果为＋＋－－。
（2）沙门菌的检验：沙门菌可引起伤寒、副伤寒、急性肠胃炎及败血症等多种疾病。该群细菌主要寄生在人和动物肠道内，因此以动物脏器为原料制成的药物，被污染的概率较高。药典规定口服脏器药物除不得检出大肠埃希菌外，亦不得检出沙门菌。
1）增菌培养：沙门菌的增菌培养通常采用四硫黄酸钠增菌液。
2）分离培养：将增菌培养物接种于SS琼脂平板上，经培养后，沙门菌均呈无色透明（或半透明）细小菌落，产H2S的沙门菌菌落中心呈黑褐色。
3）染色镜检：应为革兰阴性短小无芽孢杆菌。
4）生化反应：主要生化特性见表41-6。
表41-6 沙门菌属的主要生化反应
5）血清学鉴定：取被检细菌与沙门菌A～F多价O诊断血清作玻片凝集试验，若发生凝集则可判为沙门菌。
沙门菌的主要鉴定依据为：①革兰阴性短小无芽孢杆菌；②SS琼脂平板上的菌落为无色、透明或半透明，或中心呈黑褐色；③生化反应结果应符合表41-6；④可与沙门菌A～F多价0诊断血清发生凝集。
（3）铜绿假单胞菌的检验
铜绿假单胞菌是条件致病菌，特别在大面积烧伤、烫伤患者，眼科疾病和其他外伤后，常因感染铜绿假单胞菌后病情加重，造成患者伤处化脓，严重的可引起败血症，眼角膜溃疡甚至失明。因此，一般眼科制剂和外伤用药中不得检出铜绿假单胞菌。
1）增菌培养：将待检药物接种于肉汤培养基中进行增菌培养。铜绿假单胞菌繁殖后，可在液体表面形成菌膜。
2）分离培养：挑取菌膜接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上作分离培养。
3）染色镜检：应为革兰阴性短小无芽孢杆菌。
4）生化反应：以氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、42℃生长试验等加以鉴定。
铜绿假单胞菌的主要鉴定依据为：①革兰阴性短小无芽孢杆菌；②十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上铜绿假单胞菌呈扁平湿润、边缘不整齐、绿色带荧光的菌落。因产生水溶性绿色色素，故扩散至培养基中使之呈绿色；③氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、42℃生长试验均呈阳性。
（4）金黄色葡萄球菌的检验
金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中致病力最强的一种细菌，若经皮肤、黏膜感染人体，可引起人体局部化脓感染，严重者可导致败血症。目前规定，凡外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌。
1）增菌培养：采用亚碲酸钠肉汤培养基作增菌培养。
2）分离培养：取增菌培养物接种于卵黄高盐琼脂平板或甘露醇高盐琼脂平板或血液琼脂平板。
3）染色镜检：为革兰阳性葡萄状排列的球菌。
4）生化反应：主要用血浆凝固酶试验加以鉴定。
金黄色葡萄球菌的主要鉴定依据是：①革兰阳性葡萄球菌；②血液琼脂平板上菌落呈金黄色，周围有透明溶血环，在高盐培养基上能生长并形成金黄色菌落；③血浆凝固酶试验为阳性。
（5）破伤风梭菌的检验：破伤风梭菌广泛分布于自然界，特别是土壤中。若经伤口感染人体，可引起破伤风。以植物的根、茎为原料的药品，常可受到破伤风梭菌的污染。因此，用于深部组织、创伤和溃疡面的外用制剂不得检出破伤风梭菌。
1）增菌培养：破伤风梭菌是专性厌氧菌，增菌时，通常将被检药物加入葡萄糖疱肉培养基中，置于无氧环境中培养。
2）分离培养：将上述培养物接种到血液琼脂平板上，进行厌氧培养。
3）染色镜检：应为革兰阳性杆菌，菌体顶端有芽孢。
4）毒力试验：将分离出的可疑菌制成菌液，于小白鼠皮下注射0.3～0.5 mL，6～48小时内观察动物反应。若小白鼠出现后腿强直痉挛或全身抽搐、尾部竖起并强直等症状，则毒力试验为阳性。为证实小白鼠的症状是由破伤风外毒素所致，应同时进行破伤风抗毒素保护试验。即取适当稀释的破伤风抗毒素和待检菌液各0.3～0.5 mL给另一小白鼠注射，若小白鼠未出现上述症状，则可确认被检药物中检出的是破伤风杆菌。
破伤风梭菌的主要鉴定依据是：①革兰阳性细长杆菌，芽孢位于菌体顶端，形似鼓槌状。②疱肉培养基中生长后，消化肉渣变黑；血液琼脂平板厌氧培养后形成菌落扁平、呈羽毛状，周围有透明溶血环。③毒力试验为阳性。