实训17 免疫血清的制备
本实验以兔抗根瘤菌血清的制备为例说明。
一、仪器及材料
（1）菌种：艾特利根瘤菌。
（2）动物：2～3 kg 的健康雄家兔或未怀孕的雌家兔。
（3）药品、试剂：生理盐水、完全弗氏佐剂、1%硫柳汞。
（4）器材：一次性注射器、碘酒酒精棉球、10 ×100 试管、100 mL 血清瓶。
二、方法与步骤
（1）制备抗原：用YMA 斜面培养艾特利根瘤菌3 天，用0.5%石炭酸生理盐水洗涤3 次后制成悬液；100 ℃水浴处理1 h，用麦氏比浊管将菌液浓度调至109 个/mL，保存于50 mL血清瓶备用，加1 滴1%硫柳汞防腐，于4 ℃冰箱保存。
（2）免疫兔子：以艾特利根瘤菌菌悬液为抗原按表5.1 对兔子进行免疫。
表5.1 免疫日程表
取2 mL 抗原与2 mL 完全弗氏佐剂于小烧杯，60 ℃水浴中充分混合（用无针头1 mL 一次性注射器来回抽吸）。取1 mL 抗原-佐剂混合物注射兔子后腿肌内。两周后，不加佐剂对兔子进行静脉注射，抗原剂量为1 mL。4 周后，再对兔子进行一次静脉注射。
（3）抗体效价测定：最后一次注射7 天之后，对兔子进行耳缘静脉取血5 mL。待血液凝固后吸出血清，保存于10 mL 血清瓶中。取10 支血清管（10 ×100 试管），用生理盐水按图5.1 对免疫血清进行稀释。另取2 支相同试管作对照，编号为11 和12，取2.5 mL 生理盐水分别加入这2 支试管中。在1—11 号管中加入抗原2.5 mL，在12 管中加2.5 mL 生理盐水。将12 支试管放入60 ℃水浴中1h 后，观察实验结果，出现絮状沉淀的最高稀释度即为抗体的效价。
图5.1 抗体的稀释
（4）心脏采血：当抗体效价达到1/1 600 时，开始大量采集抗体。用20 mL 注射器从兔子心脏采血25 mL，放入100 mL 血清瓶中，待血清析出，用移液管转入另一血清瓶中，加1 滴1%柳硫汞防腐，置-20 ℃冰箱保存备用。
三、实验结果
观察血清的量及颜色，并做好标记。
四、注意事项
（1）免疫家兔时注意无菌操作，以防感染。
（2）分离血清时所用器皿要干燥、清洁以防溶血。