任务一 常用生物制品的制备及检验
一、兽用生物制品的概述
生物制品是指以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织作为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂，包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、变态反应原、细胞因子、激素、酶、发酵产品、单克隆抗体、DNA 重组产品、体外免疫诊断制品等。
生物制品包括预防用生物制品、治疗用生物制品和诊断生物制品。
1.预防用生物制品
预防用生物制品是指用于传染病或其他疾病预防的细菌性疫苗、病毒性疫苗、类毒素等人用生物制品。
2.治疗用生物制品
治疗用生物制品是指采用不同表达系统的工程细胞（如细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞）所制备的蛋白质、多肽及其衍生物，包括细胞因子、纤维蛋白溶解酶原激活因子、重组血浆因子、生长因子、融合蛋白、酶、受体、激素和单克隆抗体等；也包括从人或者动物组织提取的单组分的内源性蛋白；以及基因治疗产品、变态反应原制品、由人或动物的组织或者体液提取或者通过发酵制备的具有生物活性的多组分制品、微生态制品等生物制品。
3.诊断生物制品
诊断生物制品包括诊断血清和诊断抗原，主要用于检测相应抗原、抗体或机体免疫状态，属于免疫学方法诊断。随着免疫学技术的发展，诊断用生物制品的种类不断增多，不仅用于传染病，也用于其他疾病。主要包括：诊断血清，包括细菌类、病毒立克次氏体类、抗毒素类、肿瘤类、激素类、血型及HLA、免疫球蛋白诊断血清、转铁蛋白、红细胞溶血素、生化制剂等；诊断抗原，包括细菌类、病毒立克次氏体类、毒素类、梅毒诊断抗原、鼠疫噬菌体等。此外，还有红细胞类、荧光抗体、酶联免疫的酶标记制剂、放射性核标记的放射免疫制剂、妊娠诊断制剂（激素类）、诊断用单克隆抗体。
二、生物制品的分类
（一）疫苗
疫苗是指病原微生物、寄生虫及其组织成分或代谢产物制成并用于人工自动免疫的生物制品。通过疫苗的动物接种，刺激了机体产生免疫应答，从而抵抗特定病原微生物或寄生虫的感染，达到了预防疾病的目的。
1.活苗、灭活苗及类毒素
（1）活苗。病原微生物毒力逐渐减弱或丧失，但仍保持良好的免疫原性，用该种活的、变异的病原微生物制成的疫苗，称为活苗或弱毒苗。
优点：活苗能在体内短期繁殖，多为一次免疫使用剂量小，免疫力强，成本低，有多种免疫途径且不需佐剂。
缺点：有排毒危险或组织反应，难以制成联苗，运输保存较困难，现多制成冻干苗。
（2）灭活苗（死苗）。选用免疫原性强的细菌、病毒等经人工培养后用理化方法将其杀死（灭活）后制成的疫苗，称为灭活苗或死苗。
优点：灭活苗安全易保存，容易制成联苗或多价苗。
缺点：不能在体内增殖，免疫期短，常需多次免疫，使用剂量大且只能注射，可能有毒性等副作用。
（3）类毒素。将细菌的外毒素用0.3%～0.4%甲醛溶液脱毒制成的生物制品。外毒素经脱毒后失去毒性，但保留较强的免疫原性。
2.联苗与多价苗
（1）联苗，是指不同种微生物或其代谢产物组成的疫苗。
（2）多价苗，是指同种微生物不同型或株所制成的疫苗。
联苗与多价苗的应用可简化接种程序，减少接种动物应激反应的次数，因而对畜牧生产有利。通常的使用原则不加重接种副作用，不发生免疫干扰现象，并且能提高各个制剂或其中之一的免疫效果。
3.寄生虫疫苗
由于寄生虫大多有复杂的生活史，其虫体抗原极其复杂并具有高度多变性，因而至今仍无理想的寄生虫疫苗。多数研究者认为，只有活的虫体才能诱发机体产生保护性免疫。目前，国际上已应用并收到良好免疫效果的疫苗有犬钩虫疫苗及抗球虫活苗等，随后又相继出现了旋毛虫虫体组织佐剂苗、猪全囊虫匀浆苗、弓形虫佐剂苗和伊氏锥虫致弱苗等。
4.亚单位苗
利用微生物的一种或几种亚单位或亚结构制成的疫苗，称为微生物亚单位苗或亚结构苗；由微生物的某些化学成分制成的疫苗，称为化学苗。此类疫苗没有病原微生物的遗传信息，可免除微生物苗的一些副作用，保证了疫苗的安全性，如A 族链球菌M 蛋白疫苗及大肠杆菌菌毛疫苗等。
5.基因工程苗
近年来，随着生物技术的发展，基因工程苗已越来越受青睐。目前，已知的基因工程苗有基因工程亚单位苗、基因缺失苗、基因工程活载体苗和基因工程多决定簇颗粒性疫苗等。其中，基因工程亚单位苗为死苗，免疫原性差且成本高，因而未普遍推广。
基因工程活载体苗是以痘病毒、疱疹病毒等为载体，将目的基因插入此种病毒基因组的特定位置上，使载体病毒获得表达外源基因新特性的重组体疫苗，又称为重组活毒疫苗。
优点：一个载体病毒可插入多种抗原基因构成多价疫苗，宿主范围广，且无致瘤和致癌性，可避免母源抗体的干扰，且剂量小、成本低、易于推广。
基因工程多决定簇颗粒性疫苗，是将病原保护性抗原基因嵌合到多聚体颗粒中，使外源抗原暴露于颗粒外表面，构成多个抗原决定簇所制成的疫苗。该疫苗具有颗粒特性，因而免疫原性较好。
基因缺失苗是利用基因工程技术切去病毒基因组编码致病物质的某一片段核苷酸序列，使其致病力丧失，但仍保持免疫原性与复制成的疫苗。此种缺失株较稳定，不易发生返强现象。
（二）免疫血清
动物经反复多次注射同一种病原微生物等抗原后，机体体液中尤其血清中产生大量抗该抗原的抗体，由此分离所得的血清称为免疫血清、高免血清或抗血清。此种免疫持续时间短，只适用于治疗与紧急预防，属人工被动免疫。临床上应用的抗炭疽血清及破伤风抗毒素均属此类。
（三）诊断液
专供诊断动物传染病及寄生虫病或检测动物免疫状态和鉴定病原的生物制品，称为诊断液或诊断制剂，通常包括诊断抗原、诊断抗体（血清）。此外，标记抗体、单克隆抗体等也已作为诊断制剂而得到广泛应用。
三、疫苗制造的基本程序
（一）疫苗的菌种与毒种
1.菌种、毒种的一般要求
菌种、毒种是国家的重要生物资源，世界各国都为此设置了专业性保藏机构。一般的菌种、毒种必须符合下列要求：
（1）来源清楚，资料完整。我国《兽医生物制品制造及检验规程》规定，经研究单位大量研究选出并用于生产的现有菌种、毒种，均由国家相关部门或委托分管单位负责供应。
（2）生物学特性比较典型，指形态、生化、培养、免疫学及血清学特性以及对动物的致病性和引起细胞病变等特征均应符合标准。
（3）血清型相符。在菌种、毒种的选择时，需特别注意其血清型是否与疫苗使用地区流行的病原相符，血清型相符者才能保证免疫效果。
（4）遗传性状稳定。菌种、毒种在保存、传代和使用过程中，因受各种因素影响容易变异，因此遗传性状稳定是保证疫苗质量的重要因素之一。
2.菌种、毒种的鉴定与保存
（1）菌种、毒种的鉴定。菌种在投入大量生产之前，需进行毒力与免疫原性的鉴定及稳定性试验，从而确定强毒菌种对本动物及实验动物的致死剂量、弱毒株的致死和不致死动物范围及接种的安全程度，通过制成菌苗免疫试验动物后攻强毒确定免疫原性；对制造弱毒活苗菌种需反复传代和接种易感动物来确定其毒力是否返强。
毒种纯化、检查比较困难，通常是采用某些动物或鸡胚来鉴定。依据各自的致病力、特定组织含毒量及对动物的免疫力作为选择和鉴定的标准。
（2）菌种、毒种的程序。为了保持稳定性，最好采用冷冻真空干燥法保存菌种和毒种。冻干的细菌、病毒分别保存于4 ℃和-20 ℃以下温度，有条件的放在液氮中保存效果更好。
（二）灭活、灭活剂与佐剂
1.灭活与灭活剂
灭活是指破坏微生物的生物学特性，但尽可能避免影响其免疫原性或破坏血清中补体活性的过程。灭活的方法有物理（如加热）和化学方法两种，但疫苗生产上主要采用化学法灭活。
用来进行灭活的试剂，如甲醛、苯酚、结晶紫及烷化剂等，其中甲醛应用最为广泛。甲醛为无色气体，易溶于水和乙醇，36%～40%的甲醛溶液称为福尔马林，有强烈刺激性。甲醛的灭活作用是其醛基能够破坏微生物蛋白质和核酸的基本结构，导致细菌死亡。一般需氧菌和厌氧菌所用甲醛的浓度分别为0.1%～0.2%、0.4%～0.5%，37～39 ℃处理24 h 以上或更长时间，如气肿疽灭活苗常用0.5%甲醛溶液37～38 ℃灭活72～96 h；病毒所用甲醛浓度为0.05%～0.4%，多数用0.1%～0.3%的浓度。
灭活的效果与温度、pH 值、微生物的种类和含氮量、灭活剂的特异性及浓度以及是否存在有机物等因素有关。通常高温与碱性环境能加速灭活但易破坏抗原性，而含氮量较高及有机物的存在会消耗部分灭活剂，使灭活速度减慢。
2.佐剂
（1）佐剂的概念与要求。单独使用一般无免疫原性，而与抗原物质合用能增强后者的免疫原性和机体的免疫应答，或改变机体免疫应答类型的物质称为佐剂。佐剂必须是无毒、无致癌性及其他明显的副作用和易于吸收、吸附力强的化学纯物质；佐剂疫苗经1～2 年保存应不致引起不良反应，效力无明显改变。
（2）佐剂的分类与常用佐剂。
①储存型。有不溶性胶体液和油乳佐剂。
不溶性胶体液：Al（OH）3、AlPO4、Kal（SO4）2·12H2O、Ca3（PO4）2、炭末及其他。
油乳佐剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Span 白油佐剂等。
常与抗原混合成悬浊状态，使抗原在注射局部存留时间延长，通过抗原的缓慢释放，持续刺激机体的免疫系统。
氢氧化铝胶（铝胶）是常用佐剂之一，它既有良好的吸附性，又能浓缩抗原，减少注苗剂量。铝胶成本低，使用方便，且基本无毒，因而也是人用疫苗的主要佐剂。用铝胶稀释比用生理盐水稀释的免疫效果好。但铝胶也有易引起轻度局部反应、冻后易变性、无明显的细胞免疫以及可能对人和动物的神经系统有影响等缺点。
白油Span-85 佐剂是当前的主要油乳佐剂，该佐剂用轻质矿物油（白油）作油相，Span-80或Span-85 及吐温-80 作为乳化剂。配制时可将白油与Span-80 按94∶6比例混合，再加总重量2%的硬脂酸铝溶化混匀后，116 ℃高压灭菌30 min 即为油相，将抗原溶液和吐温-80 以96∶4比例混合作为水相，两相之比为1∶1。有研究证明，同时含油相和水相乳化剂的疫苗比仅含油相的疫苗免疫效果好，在37 ℃条件下更稳定，黏度也低。
②非储存型。有生物佐剂和非生物佐剂。
生物佐剂（微生物及其产物）：结核菌、卡介苗、乳酸菌类、短小棒状杆菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、细菌脂多糖、酵母多糖等。
非生物佐剂：表面活性剂、胺及其类似物、核酸及其类似物、药物等。
四、疫苗的使用注意事项
1.疫苗接种一般注意原则与要求
（1）所用的疫苗必须与预防的疾病相符合。
（2）由疫苗引起的免疫应答确实能起到保护作用。如鸡霍乱，所得病由环境引起，注射了疫苗，饲养管理不够，看不到效果。
（3）在使用疫苗前，必须了解接种疫苗后的危险。
（4）在使用疫苗接种后注意群体观察。
2.免疫途径
选择免疫途径的原则：
（1）根据疫苗的特性：死苗，注射，活苗，不太受限制。
（2）产生了良好的应答：既可产生全身免疫，又可产生局部免疫。
（3）仿效自然感染途径。
（4）选择使用方便，节省人力。
3.常用的几种免疫途径
（1）肌内注射、皮下注射。优点：容易掌握剂量，接种密度强，免疫效果可靠。缺点：占用劳力多，易产生应激反应。
（2）黏膜接种：滴鼻、点眼、饮水、气雾。优点：先产生局部免疫，再产生全身免疫。缺点：略。
（3）滴鼻、点眼。优点：剂量准，密度强，效果可靠。缺点：费力。
（4）饮水。优点：方法简便，耗力少，反应小，副作用小。缺点：效果较差，容易漏免。其注意事项有：①剂量要大（3～5 倍）；②有较多的饮水器；③断水，在饮疫苗前，夏天断1～2 h，冬天3～4 h；④在疫苗中加入保护剂，2%脱脂乳奶粉；⑤用软水（河水、渠水），防止消毒液进入水中。
（5）气雾：疫苗雾化，吸收。优点：简便，省力，省时，效果好。缺点：容易激发某些呼吸道病。
注意事项：①雾粒30 nm 左右，过大到地面（ >200 nm），蒸发掉（ <5 nm）；②在气雾免疫前后3 d，添加抗生素，预防慢性呼吸道病。
4.免疫程序
疫苗接种的间隔时间、次数、接种方法、剂量等，动物年龄，疫苗种类。可依据以下内容：
（1）当地疾病流行情况及其规律。
（2）根据畜禽的种类、用途、饲养管理条件、畜禽及其产品上市的旺季。
（3）母源抗体的水平。
（4）疫苗的种类、性质、免疫途径及免疫期。
五、生物制品制备技术
1.疫苗制备
（1）细菌性灭活苗的制备。种子培养（注意选强毒株细菌）；菌液培养；灭活与浓缩；配苗与分装。注意，整个过程都必须在无菌条件下按照无菌操作进行。
（2）细菌性活疫苗的制备。包括：种子液及菌液培养（选择合格的弱毒菌种）；浓缩、配苗与冻干。
（3）病毒性组织苗的制备。包括：种毒与接种，收获与制苗。
制备弱毒苗需要按无菌操作剔除脏器上的脂肪与结缔组织，称重后剪碎并加适量保护剂制成匀浆，过滤和适当稀释后加余量保护剂及青霉素和链霉素各500～1 000 IU/mL，摇匀并在0～4 ℃储存，检测合格的分装并冻干。
制备组织灭活苗可收获组织脏器，经纯度检验和毒价测定，合格的按比例加平衡液和灭活剂制成匀浆，灭活后分装和标记，0～4 ℃保存。
（4）病毒性禽胚苗的制备。过程与病毒性组织苗过程相似。
2.免疫血清制备
详见抗体部分。
3.卵黄抗体的制备
（1）将抗原接种于健康鸡，一般免疫2～3 次，每次间隔10～14 天，待卵黄琼扩反应效价达1∶128 以上收蛋。
（2）无菌操作取出卵黄，加入适量灭菌生理盐水或PBS，充分捣匀后用纱布过滤。
（3）用辛酸提取抗体，加入终浓度0. 01%硫柳汞及青、链霉素使终浓度为1 000 IU（μg）/mL 而制成。