实训16 大肠杆菌灭活苗的制备
一、基本原理
致病性大肠杆菌能引起人和多种动物发病，其有效的防控手段多为抗生素治疗与疫苗免疫。大肠杆菌灭活苗是一种常见的大肠杆菌疫苗类型，制作方法一般是将动物体分离或实验室保存鉴定的大肠杆菌菌株，经扩增培养，制备适当浓度，用甲醛灭活，使大肠杆菌失去毒力但又保持免疫原性，制成灭活疫苗，此外在疫苗中添加白油佐剂，有利于增强疫苗的免疫效果。
甲醛是最古老常用的灭活剂，现在我国用的26 种灭活疫苗，均以甲醛为灭活剂。甲醛水溶液又称福尔马林，是一种活泼的烷化剂，可作用于蛋白质氨基酸上的氨基、羧基、羟基和巯基，分别产生经甲基胺、亚甲基二醇单酯、经甲基酚和硫代亚甲基二醇，以羟甲基替代敏感氢原子，破坏生命基本结构，导致细菌死亡和病毒灭活。
乳化剂是一种降低其他溶液表面张力作用的物质，可使一种物质分散混合于另一种不相溶的液体中。司盘-80 或吐温-80 是乳化剂，它们可使油类和水剂疫苗乳化均匀。
二、仪器与材料
分光光度计、超净台、离心机、组织匀浆器、恒温培养箱、培养皿、涂布器、棉签、三角烧瓶、牛肉膏培养基、生理盐水、大肠杆菌、甲醛、白油、司盘-80。
三、方法与步骤
（一）细菌的培养
1.细菌复苏
将冰箱保存的大肠杆菌取出，自然解冻，用接种环在营养琼脂平板上划线培养，37 ℃培养18～24 h。
2.细菌鉴定
将培养的细菌挑去单个菌落，革兰氏染色，用显微镜观察。
3.细菌增菌
挑取与镜检菌落一样的菌落到普通肉汤培养管中增菌培养，37 ℃摇床培养8 h，将菌液取出均匀涂抹于营养琼脂平板表面，37 ℃培养18～24 h，以灭菌生理盐水洗下所有培养物，置灭菌三角瓶中。
（二）油乳剂灭活苗的制备
1.灭活
取细菌培养液，以灭菌生理盐水稀释至含细菌总数为15 ×108 mL（麦氏比浊法5 号管），加入菌液体积0.4%的福尔马林，于37 ℃恒温条件下灭活48 h，其间每隔4～5 h 摇振一次。
2.油相制备
将白油加热至50～60 ℃，加入6%司盘-80，不断搅拌、混匀。
3.乳化
将油相加入烧杯中电动搅拌，缓慢加入水相（油相、水相为2∶1），逐渐增大搅拌速度，在组织搅拌机下以10 000～12 000 r/min 搅拌3 min，停2 min，重复3 次，将菌苗分装。
4.检查
（1）外观检查。观察疫苗的外观。
（2）稳定性检查。将疫苗置离心管中，3 500 r/min 离心15 min，观察有无分层或破乳。
（3）剂型检查。将疫苗滴于冷水表面，不分散为油包水型，分散则为水包油型；用出口内径为1.2 mm 的1 mL 吸管在常温下吸满1 mL 疫苗后垂直放出0.4 mL 所需时间为疫苗的黏度单位，黏度单位越小越易吸收。
（4）洁净检查。取适量灭活苗，接种于肉汤培养基上，置37 ℃，培养3 d 后，吸取培养物，观察有无细菌生长。
（5）安全性检查。深部肌内接种3 只18 日龄健康雏鸡（1 mL/只），3 只120 日龄成鸡（2 mL/只），观察有无不良反应。
（6）免疫保护试验。将疫苗分别接种到10 只18 日龄非免疫健康雏鸡，0.5 mL/只，同时设对照组3 只，不作免疫。接种前与接种后7、14、21、28、42、56 d 采血，用试管凝聚法检测抗体，免疫14 d 后用制苗菌液（0.1 mL/只）攻毒。观察免疫组和对照组的发病情况。