第三章 自身抗体
第三章 自身抗体
1.什么是自身抗体？
自身抗体是指抗自身细胞内、细胞表面和细胞外抗原的免疫球蛋白。自身抗体是自身免疫应答和自身免疫病(autoimmune disease，AID)的重要特征之一，多数自身免疫病均伴有特征性的自身抗体(谱)，自身抗体检测已成为诊断自身免疫病的重要手段。自身抗体的存在并不都提示有疾病，如5％左右正常人群中类风湿因子阳性，老年人群可能由于多种外来抗原的长期刺激，类风湿因子阳性者人数比一般人群高。自身抗体可以是器官特异性的，如抗甲状腺球蛋白抗体、抗胃壁细胞抗体、抗精子抗体等；也可以是非器官特异性的，如系统性红斑狼疮中的抗核抗体，可与很多不同器官或组织细胞核结合。
自身抗体能否致病，关键在于正常的免疫调节是否得以维持。过去认为机体能辨认自我，不产生自身抗体，实际上并非如此。正常人体可以测得抗甲状腺球蛋白及DNA抗体，细菌感染中的脂多糖亦可刺激某些自身抗体的产生，但在正常免疫调节下，这些自身抗体维持不久，最终消失而不致病。自身免疫病中的自身抗体，多数是Gell及Coombs分类的Ⅱ型及Ⅲ型免疫反应引起的损伤。
2.自身抗体根据临床意义可分为哪几类？
(1) 疾病标志性自身抗体：此类自身抗体通常只出现于某种特定疾病中，较少出现于其他疾病中，对自身免疫病的诊断价值大，但种类较少且敏感性低，如系统性红斑狼疮(SLE)中的抗Sm抗体(敏感性20％～30％)、抗rRNP抗体(敏感性20％～30％)、抗PCNA抗体(敏感性仅为2％～7％)。
(2) 疾病特异性自身抗体：此类自身抗体在某种特定疾病中敏感性高，在其他疾病也可出现，但敏感性低，如SLE中的抗双链DNA抗体(抗dsDNA抗体)，活动期敏感性70％～80％，特异性90％～95％，也可见于Ⅰ型自身免疫性肝炎和混合性结缔组织病等疾病(敏感性低于10％)。
(3) 疾病相关性自身抗体：此类自身抗体与某种特定疾病有密切相关性，但在其他疾病也可出现，如原发性干燥综合征(PSS)中的抗SSA抗体和抗SSB抗体，阳性率分别为40％～95%和65％～85%，对PSS诊断意义大，但也常出现于SLE中，阳性率分别为20％～60%和10％～15%。
(4) 疾病非特异性自身抗体：此类自身抗体可在多种自身免疫病中出现，不具疾病诊断特异性，如抗核抗体可见于多种结缔组织病中，被作为结缔组织病的筛选实验。
(5) 生理性自身抗体：在正常人中常存在针对自身抗原的自身抗体，此类自身抗体效价低，不足以引起自身组织的破坏，但可以协助清除衰老蜕变的自身成分，起到免疫自稳效应，其出现的频率和效价随年龄的增长而增高，常见的抗体有抗核抗体、类风湿因子、抗平滑肌抗体。
3.目前临床应用的自身抗体检测方法主要有哪些？
(1) 间接免疫荧光法(IIF)：这是进行抗核抗体、抗核仁抗体和抗胞质抗体筛选检测的最有效方法。此检测系统中，以组织培养细胞和器官的冷冻切片为反应底物。
(2) 双向免疫扩散(ID)：双向免疫扩散过去称为“Ouchterlony试验”，是最早用于鉴定系统性自身免疫病中自身抗体特异性的检测系统。在此系统中，琼脂凝胶是血清中抗体扩散与从相反方向扩散过来的抗原相遇的介质，在抗原与抗体间形成沉淀线。鉴定抗原抗体系统时需标准参照血清。当二者相同时，两条沉淀线在琼脂凝胶上形成一条连续的沉淀线。免疫扩散中形成的沉淀线可用来鉴定如抗Sm、RNP、SSA、SSB抗体系统及许多前述的可沉淀性抗原抗体系统。
(3) 对流免疫电泳(CIE)：CIE是免疫扩散的改良试验，采用电泳以加速抗原、抗体彼此向对方移动的速度，从而仅在几小时内便可形成沉淀线，而免疫双扩散法则需1～2日的时间。在CIE中仅能检出与抗原相比为酸性等电点的抗体，但CIE很易检出抗DNA、Sm、RNP和SSB的自身抗体。
(4) 免疫印迹法(WB)：已广泛用于测定自身抗体。在WB中，将抗原在聚丙烯酰胺凝胶从阴极向阳极中泳动，蛋白在电泳池中移动的速度与其相对分子大小成比例。许多核内、核仁内和胞质抗原可根据它们在该系统中的相对移动速度进行测定。与已知分子大小蛋白带发生反应的抗体特异性可据此初步作出判断。
(5) 酶联免疫吸附试验(ELISA)：这一抗体检测系统十分敏感，但却非常依赖于抗原制品的纯度。通常以部分纯化的组织提取物或部分纯化的重组抗原为底物。抗体与这些抗原发生反应后，加入能结合抗体浓度的指示剂。该系统存在两个问题，一个问题是部分纯化组织提取物中含有一种以上的抗原或重组抗原，这些抗原可含有细菌产物(所检测的血清可能含有针对这些细菌产物的抗体)。另一个问题是随着ELISA的敏感性增高，其特异性随之降低。在ELISA检测方法中，正常免疫球蛋白也可与抗原制品或与其本身发生非特异性结合。
4.自身抗体检测有何临床价值？
(1) AID诊断与鉴别诊断：不同的AID多具有特征性自身抗体谱，疾病标志性抗体或特异性抗体或疾病相关性自身抗体对AID诊断与鉴别诊断意义重大，对AID早期诊断、及时治疗至关重要。
(2) AID病情评估与治疗监测：某些自身抗体与疾病活动性密切相关，通过自身抗体效价与效价的消长，可判断疾病的活动性，观察治疗反应，指导临床治疗。临床常见的疾病活动性相关自身抗体，如SLE中的抗dsDNA抗体、原发性系统性血管炎中的抗PR3抗体和抗MPO抗体，实验室应强调定量、定期检测。
(3) AID病程转归与预后判断：某些自身抗体与疾病发展、转归相关，如局限型系统性硬化症中抗着丝点抗体阳性患者预后良好，而弥漫型系统性硬化症中抗Scl70抗体阳性且长病程患者预后较差。
(4) AID致病机制的研究：通过自身抗体临床应用实践，可进一步研究和阐明发病机制。
5.什么是抗核抗体？
抗核抗体(ANA)是一组将自身各种细胞核成分作为靶抗原的自身抗体的总称。ANA主要是IgG，也有IgM、IgA和IgD，无器官和种属特异性，故该类抗原可与所有动物的细胞核发生反应。ANA主要存在于血清中，也可存在于胸腔积液、关节滑膜液和尿液中。
6.ANA最常用的检测方法是什么？
ANA检测最常用间接免疫荧光法(IIF)，其是最为准确的ANA筛查试验，目前最常用核质丰富的培养细胞——HEp-2细胞作为抗原。
7.IIF方法为什么要选用HEp-2细胞作为抗原包被?
HEp-2是人的喉癌上皮细胞，选用HEp-2细胞作为抗原包被是因为：
(1)hEp-2细胞是人来源的，因而其抗原谱更丰富，特异性强，含量高，更适合检测人的特异性抗体。
(2)hEp-2细胞通过细胞培养可以大量繁殖，更易标准化。
(3)hEp-2细胞具有更大、更明显的细胞核，细胞结构清晰，通过荧光模式，各类细胞核抗体更易被区分。
(4)hEp-2细胞有丝分裂的比率明显高于肝组织，更易识别出有丝分裂特异性抗体，对其诊断也更为可靠。
(5)hEp-2细胞具有更高的检出率，较肝片检测ANA阳性率提高了10％～20％。
8.免疫荧光法检测ANA常见的核型有哪些？有何临床意义？
常见的核型有均质型、颗粒型、核膜型和核仁型。其临床意义分别为：
(1) 高效价的均质型主要见于SLE患者，低效价均质型可见于类风湿关节炎、慢性肝病、传染性单核细胞增多症或药物诱发的红斑狼疮患者。
(2) 高效价的颗粒型主要见于混合性结缔组织病(MCTD)，同时也见于SLE、硬皮病、干燥综合征(SS)等自身免疫病。
(3) 高效价的核膜型几乎仅见于SLE，特别是活动期SLE，且提示病情活动。
(4) 核仁型在硬皮病中出现率最高，也可见于雷诺现象，偶尔出现于SLE。
9.常见自身免疫病的ANA阳性检出率是多少？
常见自身免疫病的ANA阳性检出率见表3-1。
表3-1常见自身免疫病的ANA阳性检出率
10.抗dsDNA抗体的临床意义是什么？
抗dsDNA抗体对诊断SLE有较高的特异性，且抗体效价的消长与SLE疾病活动程度相关，随着疾病活动的控制，抗dsDNA抗体效价可以下降或消失。已证明该抗体与DNA结合成免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或直接作用于肾小球抗原而造成SLE患者的肾损害。抗dsDNA抗体阳性的患者较阴性患者发生肾炎的危险性高12倍。测定抗dsDNA抗体的方法很多，其中间接免疫荧光法较敏感，短膜虫或马疫锥虫为底物的间接免疫荧光法具特异性。低效价的抗dsDNA抗体也可在多种疾病甚至正常人中出现。
11.什么是ENA？
ENA是可提取核抗原的总称，ENA可用盐水或磷酸盐缓冲液从细胞核中提取。ENA属非组蛋白的核蛋白，为酸性蛋白抗原，是由许多小分子RNA(100～215个核苷酸)与各自对应的特定蛋白质组成的核糖核蛋白颗粒，该组成使其各自的抗原性得以增强，分子中不含DNA。
12.抗ENA抗体的检测方法是什么？
检测抗ENA抗体谱的方法较多，早期常用的方法有双向免疫扩散(ID)，对流免疫电泳(CIE)，但敏感度和特异性较低。目前最常用的方法有免疫印迹技术和斑点酶免疫技术。(https://www.daowen.com)
13.抗ENA抗体检测的临床意义有哪些？
(1) 抗Sm抗体：仅发现于SLE患者中，是SLE的血清标志抗体，已列入SLE的诊断标准。30％～40％的SLE患者抗Sm抗体阳性，抗体阴性不排除SLE。相对抗dsDNA抗体而言，抗Sm抗体水平不与SLE疾病活动性相关，亦不与临床表现相关，治疗后的SLE患者也可存在抗Sm抗体阴性。抗Sm抗体的检测对早期不典型的SLE诊断具有很大帮助。
(2) 抗RNP抗体：是诊断MCTD的重要血清学依据，列入MCTD的诊断标准。阳性检出率可高达95％，无论在疾病的活动期或缓解期，高滴度的抗RNP抗体均可持续存在。无疾病特异性，在其他自身免疫病中亦可检出。
(3) 抗SSA(Ro)抗体：抗SSA抗体主要见于pSS，阳性率达40%～95%。其可引起亚急性皮肤型狼疮(SCLE)的皮损，抗体阳性率为70%～90%；还可引起新生儿狼疮综合征(NLE)，抗体的阳性率为90%，与胎儿的传导系统结合，可造成先天性心脏传导阻滞。
(4) 抗SSB(La)抗体：抗SSB抗体对诊断SS具有高度特异性，是SS的血清特异性抗体，pSS阳性率为65%～85%。抗SSA抗体和抗SSB抗体常常同时出现，抗SSB抗体较抗SSA抗体诊断SS更为特异。
(5) 抗rRNP抗体：血清中出现本抗体代表SLE的活动，同时往往提示有神经精神性狼疮(NPSLE)或其他重要内脏的损害。
(6) 抗Scl-70抗体：几乎仅在系统性硬化症(SSc)患者中检出，在其他自身免疫病中极少有阳性检出，正常人均为阴性。
(7) 抗PM-Scl抗体：主要见于SSc，18％的多发性肌炎/系统性硬化症重叠症可检出抗PMScl抗体。
(8) 抗Jo-1抗体：最常见于多发性肌炎(PM)，阳性检出率可达40％～50％，在多发性肌炎/皮肌炎患者的阳性检出率为25％，单独皮肌炎患者中的检出率不足10％，在其他自身免疫病中抗Jo1抗体几乎为阴性。
(9) 抗着丝点抗体(ACA)：与局限性硬皮病相关，亦可见于原发性胆汁性肝硬化。
(10) 抗dsDNA抗体：诊断SLE的标记抗体之一，多出现在SLE的活动期，抗dsDNA抗体的含量与疾病活动性密切相关。
(11) 抗核小体抗体：主要见于SLE患者血清中，对SLE的诊断特异性达到95％。
(12) 抗组蛋白抗体：通常见于药物诱导的红斑狼疮(95％)。
14.抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)的主要类型及其主要靶抗原有哪些？
主要的ANCA有两型：胞质型(cANCA)和核周型(pANCA)。
cANCA针对的主要靶抗原是蛋白酶3(PR3)；pANCA针对的主要靶抗原是髓过氧化物酶(MPO)。
15.ANCA的检测方法有哪些？
ANCA的检测方法可分为总ANCA和特异性ANCA检测两种。总ANCA检测通常采用IIF，特异性ANCA检测最常用的是ELISA法。
16.ANCA的临床意义是什么？
ANCA检测是原发性小血管炎患者的诊断、疗效观察、病情活动和复发的一项重要指标。ANCA的效价与疾病活动性相关，ANCA效价的增高或持续增高，提示病情恶化或缓解后再发。动态监测ANCA对预测疾病复发有重要意义。
MPO主要与显微镜下多血管炎(MPA)、ANCA相关性坏死性新月体肾炎(NCGN)、变应性肉芽肿性血管炎(CSS)相关。MPO-ANCA还可见于其他一些疾病，如结节性多动脉炎(PAN)、抗肾小球基底膜疾病(抗GBM病)、肉芽肿性多血管炎(GPA)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、药物性狼疮(druginduced lupus，DIL)和Felty综合征等。蛋白酶3(proteinase 3，PR3)最初是由Baggiolini等在1978年首先报道的存在于中性粒细胞胞质的一种抗生素，PR3是继人白细胞弹性蛋白酶(HLE)及组织蛋白酶G(CG)后，于中性粒细胞嗜天青颗粒(初级颗粒、a颗粒)中被发现的第3个中性丝氨酸蛋白酶，故因此而命名。
PR3在临床上与GPA密切相关。cANCA诊断GPA的特异性大于90%，PR3阳性在活动期GPA有很高的诊断价值。PR3在其他多种原发性血管炎中也可被检测到，如显微镜下多血管炎、坏死性新月体肾小球肾炎、结节性多动脉炎等。PR3在临床上另一重要应用价值在于该抗体效价与病情活动一致，在GPA等原发性血管炎常被作为判断依据。
17.如何检查磷脂综合征抗体？
(1) 梅毒血清假阳性(BFPSTS)试验和性病研究实验室(VDRL)试验：BFPSTS试验在红斑狼疮或其他结缔组织疾病的阳性率为5％～19％。这两种试验的主要抗原成分为心磷脂、磷脂酰胆碱(卵磷脂)和胆固醇的混合物，因此对于血栓形成，这两种试验方法的敏感性和特异性均不高。
(2) 狼疮抗凝物(LA)：白陶土凝集时间(KCT)是LA筛选试验中较敏感的指标，对妊娠期的LA检测有重要的意义。
(3) 抗磷脂(APL)抗体、抗心磷脂(ACL)抗体：其滴度高时，临床意义更大。数次国际标准化专题研讨会制订了统一的ELISA法检测APL抗体的程序，该方法可对APL抗体的IgG、IgA、IgM类进行定量或半定量测定。现在推荐以阴性、低度、中等、高度分级。
18.为什么有人认为磷脂综合征抗体中检测β2-GPI抗体可能比ACL抗体更有意义？
近年研究认为，无论是ACL抗体还是LA，与带负电荷的磷脂结合时，都需要一种辅助因子β2-GPI抗体。β2-GPI抗体是一种能结合脂蛋白、阴离子磷脂、血小板、肝素、DNA、线粒体的载脂蛋白，磷脂与β2-GPI抗体结合，是β2-GPI抗体表面结构改变而出现被ACL抗体识别的表位，从而发生反应。有研究显示，ACL抗体似乎是直接针对含有β2-GPI抗体的阴离子磷脂复合物，或是针对β2-GPI抗体与磷脂结合中暴露的抗原决定簇的，而与不含β2-GPI抗体的磷脂无反应，因此有人认为检测β2-GPI抗体可能比ACL抗体更有意义。
19.与自身免疫性肝病相关的自身抗体有哪些？
相关自身抗体有抗平滑肌抗体(ASMA)、抗线粒体抗体(AMA)和抗线粒体抗体M2型(AMAM2)。
20.抗平滑肌抗体的检测原理是什么？
主要采用间接免疫荧光分析，以大鼠的胃、肾或肝组织或猴肝组织作为基质片，抗平滑肌抗体(ASMA)主要以平滑肌微丝中的肌动蛋白为靶抗原。待测血清中的ASMA与底物基质片的靶抗原结合后，再加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人Ig抗体，反应后可在荧光显微镜下观察平滑肌组织纤维的亮绿色荧光。
21.自身抗体的检查如何诊断类风湿关节炎？
检测自身抗体有利于类风湿关节炎(RA)与其他炎性关节炎如银屑病关节炎、反应性关节炎和退行性关节炎的鉴别。RA新的抗体不断被发现，其中有些抗体诊断的特异性较类风湿因子明显提高，且可在疾病早期出现，如抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体，抗核周因子(APF)抗体、抗角蛋白抗体(AKA)以及抗Sa抗体等。
(1) 类风湿因子：可分为IgM、IgG和IgA型。在常规临床工作中主要检测IgM型RF，它见于约70％的患者血清，其滴度一般与疾病的活动性和严重性呈比例。但RF并非RA的特异性抗体，甚至在5％的正常人也可以出现低滴度的RF，因此RF阳性者必须结合临床表现，方能诊断本病。
(2) 抗角蛋白抗体谱：有抗核周因子(APF)抗体、抗角蛋白抗体(AKA)、抗聚角蛋白微丝蛋白(AFA)抗体和抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体。这组抗体的靶抗原为细胞基质的聚角蛋白微丝蛋白，环瓜氨酸肽是该抗原中主要的成分，因此抗CCP抗体在此抗体谱中对RA的诊断敏感性和特异性高，已在临床中普遍使用。这些抗体有助于RA的早期诊断，尤其是血清RF阴性、临床症状不典型的患者。由于它们的表位都含有瓜氨酸，故称之为瓜氨酸相关自身免疫系统，此系统可能在RA的发病及发展中起作用。
22.系统性红斑狼疮的致病性自身抗体有哪些特性？
(1) 以IgG型为主，与自身抗原有很高的亲和力，如DNA抗体可与肾组织直接结合导致损伤。
(2) 抗血小板抗体及抗红细胞抗体导致血小板和红细胞破坏，临床出现血小板减少和溶血性贫血。
(3) 抗SSA抗体经胎盘进入胎儿心脏引起新生儿心脏传导阻滞。
(4) 抗磷脂抗体引起抗磷脂抗体综合征(血栓形成、血小板减少、习惯性自发性流产)，抗核糖体抗体又与NP-SLE相关。
23.系统性红斑狼疮患者血清中常见的自身抗体有哪些？
患者血清中可以查到多种自身抗体，它们的临床意义是SLE诊断的标记、疾病活动性的指标及可能出现的临床亚型。常见而且有用的自身抗体依次为抗核抗体谱、抗磷脂抗体和抗组织细胞抗体。
(1) 抗核抗体谱：出现在SLE的有抗核抗体(ANA)、抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗ENA(可提取核抗原)抗体。
(2) 抗磷脂抗体：包括抗心磷脂抗体、狼疮抗凝物、梅毒血清试验假阳性等对自身不同磷脂成分的自身抗体。结合其特异的临床表现可诊断是否合并有继发性抗磷脂综合征。
(3) 抗组织细胞抗体：抗红细胞膜抗体，现以Coombs试验测得。抗血小板相关抗体导致血小板减少，抗神经元抗体多见于NFLSLE。
(4) 其他：有少数的患者血清出现RF和抗中性粒细胞胞质抗体。
(赵静 贺晓红 车国柱)