二、钉螺调查

二、钉螺调查

（一）调查目的

钉螺调查是血吸虫病常规防治工作重要内容之一。通过调查钉螺可以了解钉螺分布及感染情况，掌握血吸虫病疫情及其变化动态，确定重点环境，是制订灭螺规划，考核灭螺效果的重要依据。

（二）调查方法

1.土表钉螺调查　土表钉螺调查是现场防治工作最常见、使用范围最多的调查方法。根据调查目的和环境，选择合适的方法开展钉螺调查，包括系统抽样调查法、环境抽查调查法、系统抽样结合环境抽查调查法、全面细查法等。

（1）系统抽样调查法：该法又称作机械抽样调查法。该法适合于初查或虽经灭螺但钉螺面积仍然较多，又散在性分布的环境。调查框的设置及调查线距、框距应根据调查环境类型及面积大小确定。对于河道、沟渠、池塘、洼地等环境，在常年水位线沿河道、沟渠两边、池塘边、洼地周边每间隔5 m或10 m（在血吸虫病传播阻断地区可采用10 m）等距离设框；对江湖洲滩、田地环境，在滩面、田地上设置若干平行的调查线，再沿调查线等距离设框。线距和框距可根据洲滩、田地面积大小确定，一般为5～20 m。滩地面积较大时，线距和框距可适当增加，但最大不宜超过50 m；面积特别大的江湖洲滩，可以先划分成若干块，然后在每块环境进行系统抽样调查。系统抽样调查法的优点是不同地段都有同等机会查到，可避免因查螺者主观因素而长期被漏查。因主观或者客观原因而长期漏查的环境，可造成大面积高密度螺区出现，应引起重视。调查结果可用于活螺密度、感染性钉螺密度、活螺框出现率的计算。

（2）环境抽查调查法：在钉螺可能孳生的环境设框调查。对于山地、坟堆、竹林等特殊环境，可采用环境抽查法进行调查。

（3）系统抽样结合环境抽查调查法：该方法又称作双重查螺法。系统抽样调查法未查到钉螺时，对一些可疑钉螺孳生环境进行设框抽查。或在系统抽样调查基础上，对适宜钉螺孳生的环境设框抽查，调查框数应足以弥补系统抽样产生的漏查误差（一般应为系统抽样框数的20％以上）。该法适用于钉螺密度较低或下降时的调查。当钉螺密度下降时，钉螺不呈散在性分布，具有聚集性，即呈负二项分布。其优点是在不同地段有同等机会被查到，避免漏查；同时检查钉螺容易孳生的环境，发现钉螺的机会较多。在血吸虫病传播阻断地区，钉螺监测可采用5 m系统抽样结合环境抽查2框的方法查螺。系统抽样结合环境抽查调查结果可用于计算钉螺面积和感染性钉螺面积。

（4）全面细查法：调查时不设框，细查全部可疑钉螺孳生环境，发现钉螺后采用系统抽样调查法进行调查。一般用于血吸虫病流行区钉螺接近消灭的地区以及难以系统抽样的小块复杂环境。其优点是可避免主观的环境抽查，检查的范围更为全面，查出钉螺的机会更多。缺点是这种查螺方法花工费时，全面推广有困难。对从有螺地区引进水生动植物进行种植和饲养繁殖的环境，可采用此法查螺。

总体而言，现有钉螺环境直接利用系统抽样法调查，如未查到钉螺再利用环境抽查法调查；对于历史有螺环境、可疑钉螺孳生环境以及其他环境，应先采用环境抽查法调查（调查框数不少于按照系统抽样法查螺应调查框数的20％），查获钉螺后再采用系统抽样法调查，检获框内全部钉螺，并解剖观察，鉴别死活和感染情况。

2.土内钉螺调查　钉螺经常出没于土表层下。水网地区土内钉螺约占40％，在冬季土层中的深度可达14 cm，其他季节一般在6 cm以内；山丘地区土内钉螺比例较低，深度也浅。土层钉螺调查可为查灭螺工作提供科学依据。

土内钉螺调查主要采用分层铲土筛螺法。以0.1 m2为单位，先检查土表钉螺，铲除框四周的表土，防止四周表土钉螺散落铲土层。然后每2 cm为一层，逐层向土层深处铲土。铲下的土用30孔/25.4 mm的铜丝筛分层筛洗钉螺，观察死活，计算钉螺在土表及每土层的分布比例和分布深度。

3.幼螺、水下钉螺调查　幼螺多生活在水中，部分成螺分布于水下。水下钉螺调查可为制订查灭螺方案提供依据，也可在血吸虫病潜在流行区等特定环境中开展调查。

（1）草帘诱螺法：6～8月为诱螺最佳季节。该法以稻草编成0.1 m2大小的方帘，按等距离的系统抽样调查法放置于河沟的近岸水面或滩地水面，经一周后取回，冲洗后检查有无成螺和幼螺，以了解水下钉螺的情况。也可用稻草把诱螺法，将稻草切成33 cm长，取20～30根稻草为一把，其中间用粗线捆扎，线的一端预留3 cm线头。按系统抽样调查法将稻草把放置于河沟岸边或滩地水面，使稻草把两端展开形成2个扇面，将草把预留的线捆于岸边柴草固定。1天后取稻草把分别放入塑料袋带回实验室，在面盆水中用毛笔刷洗检查成螺和幼螺，并按草把分别计数。

（2）漂浮物打捞：对于已经达到传播阻断标准的地区、与有螺区毗邻或有螺水系相通的非流行区，在汛期或退水后，在漂浮物较多的水域内开展携带钉螺的监测。主要采用网捞-淘洗法，即采用定制的网兜打捞工具打捞漂浮物，打捞时可使用铁耙等辅助工具，主要打捞水草等水生植物。对漂浮物进行归类、称重、登记、淘洗，详细检查每一物体上是否有钉螺以及附着的成、幼螺情况。

4.外来动植物可疑携带调查　对从流行区引进树苗、花草、芦苇、水葫芦等植物，以及从流行区运来的鱼、虾、螺等水生动物等进行钉螺监测，以防钉螺通过携带物造成扩散。

5.螺卵调查　通过螺卵调查，可了解当地钉螺的分布及其繁殖情况。在调查的地点取表层泥土，一般厚2 cm，面积为0.1 m2，放在两只相叠的铜丝筛中筛洗。上层一只筛孔较大，为30孔/25.4 mm，能挡住水草、石块等体积较大的物质，钉螺也可被留在上层筛内；下层一只筛孔较细，为60孔/25.4 mm，留住螺卵。留在下层筛内的螺卵等物体，可用水冲出倒入平皿内，再用乳头吸管把0.8 mm直径大小的球形或椭圆形边缘光滑的暗褐色颗粒吸出，这种颗粒即为螺卵。有可疑时，用解剖针剥去螺卵外层泥皮，放在解剖镜或显微镜下检查，可见透明的胶球内略带黄色发育阶段不同的卵胚，即为螺卵。6.钉螺鉴定

（1）形态鉴定：在自然环境中孳生的某些螺类，其外形同钉螺较相似，易与钉螺混淆。常见的与钉螺相似螺类主要有：方格短沟蜷（semisulcospira cancellata bonson，俗称海蛳）、真管螺（euphaedusa，俗称烟管螺）、细钻螺（opeas gracile，俗称菜螺）、拟钉螺（tricula，俗称小黑螺）等。在钉螺调查时需将其与钉螺加以鉴别。钉螺和相似螺类的鉴别可参见第一章第二节。

（2）成幼螺鉴别：成螺的长度一般在5 mm以上，壳顶不一定完整，有明显髻冠，壳呈黄褐色或暗褐色，生殖系统发育成熟。幼螺的长度一般在5 mm以下，原始螺顶完整，微带红色，无髻冠，壳呈鲜淡黄褐色，生殖系统未完全发育成熟。亦可根据螺旋数判定成、幼螺，凡螺旋数≥5者为成螺，＜5者为幼螺。成、幼螺鉴别要点见（表2-1）。

（3）存活状态鉴别：采用爬行法、敲击法、压碎法或温水法等方法，鉴定捕获钉螺的死活。

1）爬行法：将草纸铺于平底瓷盘底部，在草纸中心上画直径为5 cm的圆圈，瓷盘内加入少许脱氯水使草纸湿润。将钉螺置于草纸上的圆圈内，置室温（20～25℃）下放置24小时后，观察钉螺爬动情况。若钉螺开厣活动或爬到圈外，则为活螺。在原位不动的钉螺，通过压碎法或敲击法进一步鉴别钉螺是否存活。

2）敲击法：将钉螺置于平板玻璃或硬物上，用小铁锤轻击使之破碎，如见钉螺软组织有收缩反应则为活螺；反之为死螺。

3）压碎法：将钉螺置于平板玻璃上，每块玻片上放置钉螺若干只，钉螺相互分开另用一块较厚的玻片将钉螺轻轻压碎，用解剖针将黏附在上层玻片上的钉螺软组织拨到下面玻片上，然后在每个螺体上加一滴清水。如压碎后钉螺有收缩反应，且见新鲜软体组织者为活螺；反之为死螺。

4）温水法：将现场捕捉的钉螺洗净后放入盛20℃左右水的平皿或瓷杯中，观察2～3小时，凡有开厣活动，伸出软体组织，用针刺后有反应的为活螺。凡没有活动，用针刺无反应者，再用小锤逐个轻轻敲碎外壳，软体组织不收缩者，鉴定为死螺。

（4）钉螺雌雄鉴别

1）透视法：把洗净的钉螺放在灯光下，用放大镜透视，体螺旋背部有红色“指状”阴茎为雄螺；在螺体腹侧体螺旋底部具灰白色副腺的为雌螺。

2）直窥法：在钉螺开厣活动时，直接从壳口见阴茎的为雄螺；在钉螺交配时，拉开两螺，见阴茎的为雄螺；没有阴茎的为雌螺。需要注意有时两个雄螺也可作交配状。

3）解剖法：压碎钉螺，观察到阴茎者为雄螺，否则为雌螺。

（5）钉螺感染鉴别

1）压碎镜检法：将钉螺置于载玻片上，用另一张较厚的玻片将钉螺轻轻压碎，注意钉螺之间应保持一定距离，然后在每只钉螺上加一滴清水，将钉螺置于解剖镜（×10倍）或显微镜（4×物镜，10×目镜）下，用解剖针拨开外壳、依次撕碎钉螺消化腺等软体组织，逐个观察，发现血吸虫尾蚴和（或）胞蚴即为感染性钉螺。解剖针每解剖一只螺软组织后，应及时擦干净，防止尾蚴交叉污染。

2）逸蚴法：将钉螺放在指形试管内，每管放一只钉螺，加脱氯水至试管口，用尼龙纱或纱罩盖好管口，防止钉螺外爬。置于20～25℃、光照条件下，4～8小时后，用肉眼或放大镜在灯光下检查试管水面有无摆动或停止活动的分叉尾蚴。如鉴别不清时，可用白金耳（或铁丝环）取表面水滴与玻片上，在解剖镜或显微镜下鉴定。如待检钉螺数量较多，感染率又不高时，可用较大的指管，每管放10只钉螺，对检出有感染性钉螺的指管，再按照单个螺逸蚴的方法辨别感染性钉螺。

3）血吸虫核酸检测法

钉螺处理：将钉螺置于载玻片上，用另一块较厚的玻片将钉螺轻轻压碎，尽量弃去螺壳残渣，仔细挑取钉螺软体组织至干净的离心管（1.5 ml或2.0 ml）内，移液器吸取适量的TE缓冲液（pH8.0）覆盖钉螺软体组织，漩涡振荡器振荡漂洗组织，8 000 r/min离心30秒，弃上清液。

核酸提取：将清洗干净的钉螺软体组织用商用或者自行配制的组织基因组提取试剂（通过研磨—匀浆组织—消化裂解—DNA结合—洗脱等步骤）提取DNA，紫外可见分光光度计测定DNA含量及纯度。亦可进一步行1.0％琼脂糖凝胶电泳测试基因组提取质量。

基因扩增：将提取的基因组DNA作为模板，以日本血吸虫特异性引物为探针，用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、荧光定量PCR等方法进行核酸扩增反应，通过观察颜色反应或有无目的条带等判断被检钉螺中有无血吸虫特异性核酸序列，以判定钉螺血吸虫感染情况。

（三）注意事项

钉螺调查是一项群众性和技术性很强的工作，具有明显的季节性，必须在各级政府的统一领导下，组织查螺队伍。查螺人员必须事先进行业务培训，查螺工作要按照工作计划有序进行。查螺过程中要注意个人安全防护。在野外环境中，要做好个人防护，避免被昆虫叮咬；在气温较高的时候，避免长时间工作，防止中暑；在杂草比较茂盛的地方，要防止毒蛇咬伤；在岸边陡坡查螺时，要注意防止滑跌落水。