1.15.4　使用siNotch1逆转实验

1.15.4　使用siNotch1逆转实验

因为本文在国内外首次报道RND3通过Notch1调节细胞活性，因此，逆转实验需要完全可信的结果。本研究在1.15.3中已经使用Compound E阻滞Notch1信号通路进行逆转实验，并取得了阳性结果，为了进一步确定这个结果，我们使用siNotch1阻滞Notch1信号通路进行验证。

在1.15.2中，我们已经发现，siRND3在转染24h后可以敲低RND3，siNotch1则需要36h才能敲低Notch1信号通路90%以上，抑制作用可以持续96h，因此，我们需要先转染siNotch1，12h后再次转染siRND3。我们通过预实验发现，U251细胞可以进行两次电转，而细胞能较好的贴壁生长，故本研究使用两次电转。

实验分组为：

（1）对数期生长的U251，胰酶消化，计数；

（2）电转1（转染siNotch1及对照）；(https://www.daowen.com)

（3）转染后细胞铺入六孔板；

（4）15h后，电转2（转染siRND3及对照）；

（5）转染后细胞铺入六孔板，继续培养；

（6）转染72h后计数细胞，应用one way anova检验各组之间差异有无统计学意义；转染72h后提取RNA，荧光定量PCR检测HES1的mRNA表达量，应用one way anova检验各组之间差异有无统计学意义。