一、连接酶

连接酶（ligase）是一类能将两个核酸片段连接起来的酶。目前已研究发现多种不同来源或作用于不同底物的连接酶类，这里主要介绍E.coli DNA连接酶、热稳定DNA连接酶和T4 RNA连接酶。

DNA连接酶（DNA ligase）借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA中相邻的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键，在基因工程中用来将不同来源DNA链连接起来，形成重组DNA。在基因工程中常用到的DNA连接酶主要是E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。E.coli DNA连接酶由一条分子量为75 kD的多肽链构成，可被胰蛋白酶水解。噬菌体T4 DNA连接酶分子是一条分子量为60 kD的多肽链，其活性可被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。T4 DNA连接酶可催化DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA黏性末端或平头末端之间的连接反应。连接酶催化DNA连接的最佳反应温度是30℃。

T4-DNA连接酶与大肠杆菌连接酶相比在基因工程中的应用更广泛一些，包括：①修复双链DNA上的单链缺口（与大肠杆菌DNA连接酶相同），这是两种DNA连接酶都具有的基本活性；②连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，前者反应速度较快；③连接两个平末端双链DNA分子，由于这个反应属于分子间连接，反应速度的提高依赖于两个DNA分子与连接酶三者的随机碰撞，因此在一般连接反应条件下速度缓慢，但向反应系统中加入适量的一价阳离子（比如150 mmol/L的NaCl）和低浓度的聚乙二醇（PEG），或者适当提高酶量和底物浓度均可明显提高平末端DNA分子间的连接效率。

热稳定DNA连接酶，是从嗜热高温放线菌中分离得到的，它能够在高温下催化两条寡核苷酸探针的连接反应。这种酶在85℃高温下都具有连接酶的活性，而且在多次重复升温到94℃之后仍能保持较好的连接酶活性。