黏性末端DNA片段的连接

1.相同黏性末端的连接

在DNA分子连接操作中，相同黏性末端最适合DNA片段的连接。许多限制性内切酶在识别位点处交错切割DNA分子，使DNA端部生成3′或5′黏性末端。基因工程实验常选择同一种限制性内切酶切割载体和DNA插入片段，或者采用同尾酶处理载体和DNA插入片段，使两者具有相同的黏性末端。在处理好载体和DNA插入片段后，将两者加入连接体系中，载体和插入片段会很自然地按照碱基配对关系进行退火，互补的碱基以氢键相结合。在T4 DNA连接酶的作用下，载体和外源DNA片段相结合出的裂口会以磷酸二酯键相连接，形成重组DNA分子。需要特别注意的是，在使用一种限制性内切酶切割载体DNA后，载体的两个末端碱基序列也是互补的。那么在连接反应时，会发生线性的载体DNA的自身环化，形成空载体，影响外源DNA序列与载体的连接效率，导致DNA重组体的比例下降。因此，限制性内切酶切割后的载体需要用碱性磷酸酶处理一下，以防止载体自身环化。

外源DNA片段若是只被单一的限制性内切酶处理，那么其与具有相同黏性末端的载体相连形成的重组分子可能存在正反两种方向，而经两种非同尾酶处理的外源DNA片段只有一种方向与载体DNA重组。这两种情况下，重组分子均可用相应的限制性内切酶重新切出外源DNA片段和载体DNA。

2.不同黏性末端的连接

具有不同黏性末端的DNA序列无法直接相连，需将两者转变成平末端后再进行连接。但这种做法有缺陷，主要有以下几种影响：使重组的DNA分子增加或减少几个碱基对；破坏原来的酶切位点，使已重组的外源DNA片段无法回收；如果连接位点在基因编码区，那么连接后会改变阅读框，使相关基因无法正确表达。因此，不同黏性末端DNA片段的连接要根据具体情况选择不同的连接方法。

不同黏性末端之间的连接主要有以下四种方式：

①待连接的DNA片段都有5′单链突出末端。这种情况下，可以在连接反应前使用S1核酸酶将两者5′单链突出末端切除；或使用Klenow酶补平，然后对两平末端进行连接。前一种方法产生的重组DNA会少掉几对碱基，而后一种的重组DNA较连接前没有发生碱基对的变化。实验中多采用Klenow酶补平法，因为S1核酸酶若是反应条件不合适，容易造成双链DNA的降解。

②待连接的DNA片段都有3′单链突出末端。可使用T4 DNA聚合酶将两者3′单链突出末端切除，然后将产生的平末端连接起来。这种方法产生的重组DNA较连接前会减少几对碱基。另外需要指出的是，Klenow酶不具有补平3′单链突出末端的活性。

③一种待连接的DNA片段具有3′单链突出末端，另一种具有5′单链突出末端。可以使用Klenow酶补平5′单链突出末端，同时用T4 DNA聚合酶切除3′单链突出末端，然后将产生的平末端连接起来。

④待连接的两种DNA片段均含有不同的两个黏性末端。可以首先用Klenow酶补平DNA片段的5′单链突出末端，再用T4 DNA聚合酶切除其3′单链突出末端。两种DNA片段可以混合在一起，同时处理。