影响连接反应的因素

很多因素都会影响连接反应的效率，其中主要的因素有温度、DNA末端的性质、DNA片段的大小和浓度、离子浓度等。DNA末端的性质方面在上面已谈过，下面主要谈谈其他方面。

就温度而言，T4 DNA连接酶发挥其连接活性的最适温度是30℃，在5℃以下活性大大降低。而在反应底物方面，如果待连接的DNA片段具有相同的黏性末端，则在较低的温度下，黏性末端退火可形成含有两个交叉缺口的互补双链结构。这时的连接属于分子内反应，其连接反应速度比分子间的连接速度快。所以从理论上来说，连接反应温度应选择低于黏性末端的熔点温度（T m）。大多数限制性内切酶切割产生的黏性末端T m 值在15℃以下。综合酶的最适温度和底物黏性末端的T m 值，在实际操作中，连接反应温度与时间常采用25℃连接2 h或16℃连接过夜。

在DNA片段的大小和浓度方面，一般考虑酶切回收后载体与DNA插入片段的物质的量之比来确定最佳的浓度。一般分析物质的量的比值，以回收的载体片段：DNA插入片段=1∶10～1∶3的连接效果最佳。熟练的人员凭经验即可以知道每次连接所需的具体量。但初学者则需要不断从头认真计算，一般取载体0.03 pmol，取DNA插入片段0.3 pmol。需要加入的反应体系的体积则根据载体和DNA插入片段的分子大小和浓度来具体计算。