实验七 肠道致病菌的分离与鉴定
一、实验目的
1.熟悉肠道的检查程序，熟悉各种培养基的用途。
2.掌握肠道致病菌（大肠埃希菌、志贺菌属、伤寒沙门菌）的形态特点。
3.掌握肠道致病菌的鉴定方法。
二、实验材料
大肠埃希菌、志贺菌属、伤寒沙门菌革兰氏染色形态示教片、SS琼脂平板、双糖铁培养基、琼脂平板、半固体培养基、双糖铁培养基。
有关培养基的配制：
1.SS琼脂平板：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、乳糖10 g、胆盐8.5 g、枸橼酸钠8.5 g、硫代硫酸钠8.5 g、琼脂20 g、枸橼酸铁1 g、0.1%煌绿溶液0.33 ml、1%中性红溶液2.5 ml、蒸馏水1000 ml。除了煌绿、中性红以外，将其他各成分混合于蒸馏水中，加热溶化，调p H至7.0再加入煌绿和中性红分装于三角烧瓶中，以68.95 kPa高压灭菌10分钟，待冷至50℃左右倾注于无菌平板中冷后备用。适合于粪便标本中肠道致病菌的分离。
2.双糖铁培养基：蛋白胨20 g，牛肉膏3 g，酵母膏3 g，乳糖10 g，葡萄糖1 g，氯化钠5 g，柠檬酸铁铵0.5 g，硫代硫酸钠0.5 g，琼脂12～15 g，4 g/L酚红水溶液6 ml，蒸馏水1000 ml。除糖类和酚红外，其他各成分均加热溶解，矫正p H至7.4～7.6，再加入糖类和酚红水溶液，混匀，过滤分装，每管3 ml，121℃灭菌15分钟，取出后制成斜面。
3.蛋白胨水培养基的制备：将蛋白胨1 g、Nacl 0.5 g加入蒸馏水100 ml，调p H值为7.6，分装试管，每管3～4 ml。经121℃高压灭菌15 min后备用。
4.醋酸铅培养基的制备：将醋酸铅0.5 g、硫代硫酸钠0.25 g等加入到500 ml 2%的肉汤琼脂中，调p H为7.4～7.6，分装试管，每管3～4 ml，经121℃高压灭菌15分钟后备用。
5.醋酸铅培养基的制备：将醋酸铅0.5 g、硫代硫酸钠0.25 g等加入到500 ml，2%的肉汤琼脂中，调p H为7.4～7.6，分装试管，每管3～4 ml，经121℃高压灭菌15分钟后备用。
三、实验方法
分离培养与鉴定具体方法。
1.取材：挑取黏液脓血样粪便置清洁容器内立即送检。若不能及时送检，应用甘油缓冲盐水保存。若无法获取粪便时，用肛拭子检查（用无菌棉拭子经生理盐水湿润后，插入肛门4～5 cm处轻轻沿肛壁擦拭一圈后取出，放入含少量甘油缓冲盐水的无菌试管中送检）。
2.粪便标本或肛拭子可直接在SS琼脂平板上划线分离培养（细菌的分离与培养）。
对血、骨髓、尿等标本可先做增菌培养，然后取增菌培养物在上述平板上划线分离，经37℃培养18～24小时。
3.SS平板分离培养：见图1。
图1 肠道致病菌的分离鉴定程序
4.SS平板菌落分离培养与鉴定具体方法：在SS平板上的2～3区可看见散落的沿划线分布的大小不同、两种颜色的菌落。一种是较大的红色菌落，另一种是较小的半透明的淡黄色或无色的菌落。较大的红色菌落是肠道非致病菌，较小的半透明的淡黄色或无色菌落是肠道致病菌，详见表1。
表1 大肠埃希菌、志贺菌属和伤寒沙门菌的生物学特征(https://www.daowen.com)
注：产酸产气，“+”产酸或阳性，“-”阴性
5.双糖铁培养基及尿素培养基的接种（表2）
从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，可先做革兰氏染色镜检，然后再接种于双糖铁斜面培养基中，37℃培养18～24小时，取出观察结果并分析。
表2 可疑菌落在双糖铁培养基及尿素培养基的生物学特征
注：产酸产气，“+”产酸或产气，“-”阴性，“+/-”少量产酸或产气，“++”一般产酸或产气，“++++”大量产酸或产气。
6.半固体培养基的接种（细菌动力观察）：另从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，可先做革兰氏染色镜检，然后再接种于半固体培养基中。若细菌沿穿刺线生长，穿刺线周围的培养基清晰，则细菌没有动力；若细菌沿穿刺线向周围扩散生长，穿刺线周围的培养基呈云雾状混浊，表明细菌有动力。
7.细菌代谢产物的观察：观察细菌在培养基中的生长情况，参照前表（肠道杆菌生物学性状）分析并作出初步鉴定，依照此结果，再用其他生化反应来做最后鉴定。
（1）单糖发酵试验：各种细菌含有不同的糖分解酶，分解糖的能力不同，代谢产物也不同，有的产酸，有的还有气体形成。因此可协助鉴别细菌，尤其是肠道细菌；用灭菌接种环分别取大肠埃希菌和伤寒沙门菌少许，分别接种于五种糖发酵管，经37℃培养18～24小时，观察结果；①糖不分解，指示剂仍为紫色，记录方式（-）；②糖分解（产酸不产气）指示剂变黄，小倒管中无气泡，记录方式（+）；③糖分解（产酸且产气）指示剂变黄，小倒管中有气泡，记录方式（⊕）。
（2）靛基质（吲哚）试验：各种细菌分解氨基酸的能力不同，借此可鉴别菌种。有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌等具有色氨酸分解酶，可分解蛋白胨中的色氨酸生成无色的吲哚即靛基质，当加入靛基质试剂（对二甲基氨基苯甲醛），形成玫瑰色吲哚，可用肉眼观察。用灭菌接种环分别取大肠埃希菌、伤寒沙门菌少许接种于蛋白胨水培养基中，经37℃培养24～48小时。取出培养物后加入2～3滴乙醚，混匀静置（使无色吲哚和乙醚一并上升至液体表面），再沿管壁加入2～3滴靛基质试剂于培养物表面，在两者接触面上呈玫瑰红色为阳性，黄色为阴性。
（3）硫化氢试验：有些细菌如变形杆菌、副乙型伤寒沙门菌等能分解含硫氨基酸（胱氨酸等）生成硫化氢，如培养基中含有铅盐（如醋酸铅）或者铁盐（如硫酸亚铁），硫化氢可与之结合生成黑褐色的沉淀物。
（4）醋酸铅培养基的观察：用灭菌接种针分别取大肠埃希菌、变形杆菌少许穿刺接种于醋酸铅培养基中，经37℃培养24小时。沿穿刺线部位呈现黑色为阳性，无黑色出现为阴性。
（5）色素的产生：有些细菌在代谢过程中，可合成不同颜色的色素，有利于细菌的鉴定。
1）脂溶性色素：仅菌落本身着色，培养基不染上颜色。
2）水溶性色素：色素本身可溶解，渗透到周围的的培养基中。方法：观察两种细菌的色素，其颜色、特性等。
四、实验报告
1.观察示教片并绘图。
2.记录上次SS培养基中出现的结果
3.记录上次双糖铁培养基、半固体培养基接种的结果；
4.结合肠道致病菌的系列检查结果做出最后鉴定。
5.记录细菌代谢产物的观察结果，如单糖发酵试验、硫化氢试验、吲哚试验和产生的色素。