实验一　凝集反应

实验一　凝集反应

颗粒性抗原（红细胞、细菌）的混悬液，在有电解质存在的条件下与相应抗体结合，能形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。凝集反应有直接凝集反应、间接凝集反应等多种。在凝集反应中，由于参与的抗原是颗粒性抗原，分子大、反应面积小，为使抗体分子不致过多，抗原和抗体的比例适宜，试验时须稀释抗体，并以抗体的稀释度作为凝集反应的效价。

一、玻片凝集反应

（一）实验目的

观察细菌在玻片上与其相应抗体结合所出现的细菌凝集现象，理解抗原抗体反应的特异性。

（二）实验原理

将已知细菌抗体与待测细菌混合，如果抗原与抗体相对应，则引起细菌凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断细菌种类。

（三）实验器材

1.1∶20伤寒沙门菌免疫血清，伤寒沙门菌及大肠埃希菌24小时琼脂斜面培养物。

2.生理盐水、玻片、记号笔、接种环、酒精灯等。

（四）实验方法

1.取一张干净的载玻片，于玻片的左侧和中间分别加伤寒沙门菌诊断血清1滴，右侧加生理盐水1滴。

2.用无菌接种环挑取伤寒沙门菌斜面培养物，分别与右侧的生理盐水和中间诊断血清充分混合，同样取大肠埃希菌斜面培养物与左侧诊断血清充分混合，注意无菌操作。

3.轻摇动玻片，1～2分钟后观察。

（五）结果观察

阳性：液体变清，并有乳白色凝集块出现。

阴性：液体仍然混浊，无凝集块出现（图1、图2）。

图1　凝集反应

记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容器内，切勿任意放置或冲洗。

图2　凝集反应结果对比

（六）注意事项

取细菌培养物时不宜过多，与免疫血清混合时，必须将细菌涂散、涂均匀，但不宜将面积涂得过大，以免很快晾干而影响结果观察。细菌鉴定时，特别是肠道菌种的沙门菌属或志贺菌属，原则上先用多价诊断血清检测，如为阳性，再用单价诊断血清进行分群或定型。血型测定时，室温需保持在20℃左右，若低于10℃，易出现冷凝集现象而造成假阳性的错误诊断。

二、试管凝集反应

（一）实验目的

了解试管凝集反应方法，掌握凝集效价的判定及其意义。(https://www.daowen.com)

（二）实验原理

试管凝集反应实验为定量实验，用已知抗原检测待检血清中有无相应的抗体，多用于抗体的定量检测。

（三）实验材料

1.伤寒沙门菌免疫血清，伤寒沙门菌24小时琼脂斜面培养物。

2.生理盐水、玻片、记号笔、接种环、酒精灯、消毒缸等。

（四）实验内容

1.取干净的小试管7支，依次编号。

2.在各试管中加生理盐水0.5 ml（第一管0.9 ml）。

3.稀释血清：取伤寒沙门菌诊断“O”血清0.5 ml加入第1管中，混合后吸出0.5 ml加入第2管中，混合后吸出0.5 ml加入第3管中，如此对倍稀释至第6管，从第6管中吸出0.5 ml弃去，第7管不加血清作为阴性对照，此时第1管到第6管稀释倍数分别是1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320。

4.加菌液由对照管依次向前，每管加伤寒沙门菌菌液0.5ml，此时每管稀释倍数又增加1倍。

5.振荡试管架，使管内液体充分混合，置37℃恒温箱孵育30分钟观察结果（表1）。

表1　试管凝集实验方法和结果举例

（五）结果观察

先观察生理盐水对照管（第7管），没有发生凝集、液体混浊、管底沉淀呈圆形、边缘整齐。此沉淀物为红细胞悬液静置时因重力作用自然下沉形成。然后自第6管开始依次观察管内液体的混浊程度及管底凝集块的大小。

伤寒沙门菌免疫血清对倍稀释方法：

用吸管将第1管的溶液连续吸吹3次，使其充分混匀后吸出0.5 ml移入第2管，同法使充分混匀后吸出0.5 ml移入第3管，如此做倍比稀释至第6管，从第6管吸0.5 ml弃去，第7管为不加血清对照。

（六）结果分析

1.首先观察阴性对照管，应无凝集现象，管底沉积呈圆形，边缘整齐，轻轻摇动则沉积菌分散均匀呈混浊现象。凝集结果判定以“+、-”表示。观察实验管，凝集现象可根据强弱程度，分为五级。

++++：上清液完全透明，细菌全部凝集，管底形成大片凝集物。

+++：液体较透明有轻度浑浊，细菌大部分凝集，管底的片状凝集物较小而薄。

++：液体稍透明，约半数的细菌发生凝集，管底出现凝集环。

+：仅有少部分细菌凝集，管底可见沉积的细菌周边有稀疏、点状的凝集物。

-：液体均匀浑浊，细菌因重力下降于管底呈边缘光滑的圆点（与对照管相似）。

2.血清抗体效价的判定：以出现明显凝集现象（++）的血清最高稀释度作为受检血清的抗体效价。以上所示结果，血清效价为1∶160。