实验二 沉淀反应
可溶性抗原（如细菌培养滤液、外毒素、组织浸出液和血清蛋白等）与相应抗体结合，当两者比例适宜并有电解质存在时，形成肉眼可见的白色沉淀物，这个过程称为沉淀反应。沉淀反应可分为环状沉淀反应、絮状沉淀反应、琼脂扩散等多种。在沉淀反应中，由于参与的抗原是可溶性抗原，分子小，在单位体积内所含的抗原量多，与抗体结合的总面积大。为了使抗原和抗体的比例适宜，试验时常需稀释抗原而不是抗体，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。琼脂扩散试验有单向和双向扩散两种基本类型。琼脂扩散试验与电泳技术结合，又衍生出多种方法，如对流免疫电泳、火箭电泳、免疫电泳等。
一、单相琼脂扩散试验
（一）实验目的
1.掌握单向琼脂扩散试验的原理及意义。
2.掌握单向琼脂扩散的操作技术。
（二）实验原理
单向琼脂扩散试验是一种定量的血清学测定方法，将某种特异性抗体混合于琼脂中制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的抗原加入孔中。抗体与琼脂混合后不会再扩散，只有孔中抗原向四周呈辐射状扩散，如抗原与已知的抗体相对应，在两者比例适合处即出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环，沉淀环的大小（直径成面积）与抗原浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环的直径作为纵坐标，以抗原浓度为横坐标可绘制标准曲线，待测抗原可在同样条件下测得沉淀环直径，然后从标准曲线中求得其含量。因此，该试验系定量试验，主要用于测定血清IgG、IgM、Ig A和补体成分的含量。
（三）实验材料
1.抗体：羊抗人IgG单价抗血清。
2.抗原：待检血清。
3.3%生理盐水琼脂、生理盐水、载玻片、直径3 mm打孔器、小三角烧瓶、毛细滴管、湿盒。
（四）实验方法
1.制备含抗体的琼脂板：取羊抗人IgG单价抗血清一瓶（效价1∶80），取0.3 ml于一个小三角烧瓶中，加生理盐水11.7 ml（40倍稀释混匀，置56℃水浴中恒温2～3分钟）。
取3%生理盐水琼脂一管，隔水加热溶解，然后置56℃水浴中，待琼脂温度降至56℃时立即加入等量1∶40稀释抗血清迅速轻轻混匀，勿使之产生气泡，迅速倾入载玻片上，每片3.5 ml，待凝固后打孔（图1）。
2.稀释待检血清：将待检血清用生理盐水作40倍稀释，
3.打孔、加样：每份检样加两孔，加满（但不要溢出），加样时毛细滴管尖端不要划破琼脂。
4.温育：将琼脂板置搪瓷盒，垫湿纱布或海绵以防干燥，37℃恒温箱24小时。
（五）结果分析
测量并求出每份检样两孔的沉淀环平均直径，按照标准曲线求出IgG含量。
图1 单向琼脂扩散实验标准曲线图(https://www.daowen.com)
二、对流免疫电泳
（一）实验目的
1.掌握对流免疫电泳的原理及意义。
2.掌握对流免疫电泳的操作技术。
（二）实验原理
在一定条件下，胶体颗粒是带有电荷的，这些带电胶体颗粒在电的影响下发生移动。如胶体颗粒带负电，则移向阳极；反之，移向阴极，这种现象称为电泳。
对流免疫电泳是将患者血清（待检抗原）放在琼脂板阴极端孔内，已知抗血清（含有已知抗体）放于阳极端孔内，在碱性环境条件下同时进行电泳，抗原由阴极向阳极移动快，而抗体系丙种球蛋白，等电点在p H6～7时，故带负电荷少，移动速度慢。由于电渗作用结果向阴极倒退，于是抗原抗体在电场中相遇，当两者比例适当时，则特异性抗原抗体互相结合，便形成肉眼可见的白色沉淀线。
（三）实验材料
1.1%、p H8.6、0.075M巴比妥缓冲液。
2.抗AFP血清、已知AFP阳性血清、待检患者血清。
3.玻片、吸管、打孔器、毛细滴管、电泳仪等。
（四）实验方法
1.将用缓冲液配制好的1.2%琼脂隔水加热溶化，趁热吸取3.5 ml加于玻片上，冷凝后打孔，孔直径3 mm，两孔间距离3 mm。
2.分别从上至下向左列1、3、5孔内加入抗AFP血清，向右列2孔内加待检患者血清，4孔内加已知AFP阳性血清作为阳性对照，6孔内加已知阴性对照血清。各孔加满为度，勿使外溢。
3.将琼脂板置于电泳槽内，抗原端入阴极侧，抗体放阳极侧，两端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。
4.通电，固定电压5～6 V/cm，通电45～60分钟。
（五）结果观察
电泳毕，关闭电源取出琼脂板。在黑色背景上方透过散射光线，首先观察3与4孔间（阳性对照组）、5与6孔间（阴性对照组）的白色沉淀线是否出现。再看试验孔，如孔间未出现这样的沉淀线，则该待检血清为AFP阴性血清（图2）。
图2 电泳结果