实验三 补体结合试验
一、实验目的
认识补体的激活物能产生裂解细胞壁的功能因子。
二、实验原理
补体能使溶血素（抗绵羊红细胞抗体）致敏的绵羊红细胞（SRBC）发生溶血，当致敏的绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性呈正比例关系。因此，将新鲜待检血清做不同稀释后与致敏红细胞反应，测定溶血程度，以50%溶血时的最小血清量判定终点，可测知补体总溶血活性。补体活性与溶血程度的关系呈“S”形曲线。在50%溶血周围，线段近似一条直线。因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。所以用50%溶血作为终点要比100%溶血更为敏感。补体与颗粒型抗原抗体复合物结合时产生溶解反应。如果颗粒型抗原为绵羊红细胞，可发生溶血反应。
三、实验材料
1.豚鼠血清。
2.抗绵羊血细胞的兔血清。
3.2%绵羊红血球。
4.小试管、试管架、生理盐水、水浴锅。
四、实验操作
1.制备绵羊红细胞悬浮液：
（1）采血：在绵羊（最好母绵羊）颈静脉无菌采血。将40 ml的血与60 ml阿氏液混匀冷藏备用。供血羊一次采血量最多不要超过200 ml，采血间隔不少于6周。
（2）洗红细胞：将10 ml阿氏液保存的绵羊血通过纱布过滤倒入40ml刻度离心管内，另加30 ml生理盐水混匀。在水平转子离心机上离心10分钟（500G）。吸弃上清液，加生理盐水至原来的量，再次离心，如此离心洗涤三次。吸弃上清液。每管约加10 ml PBS混匀。将悬液倒入15 ml容量的刻度离心管中，离心10分钟（500G），储存于4℃～8℃冰箱备用。红细胞可保存5～6天。
（3）制备2%绵羊红细胞悬浮液：1）选择一管洗过的红细胞，如果红细胞与液面间出现溶血应再离心洗涤，直至清亮。若多次洗涤仍有溶血，则表示红细胞太脆或缓冲液有问题，应弃去不用。
2）记录红细胞的毫升数，吸弃上清液，用VBS稀释红细胞，使成为5%的红细胞悬液（1 ml红细胞+19 ml VBS）（表1）。
表1 溶血素效价的滴定(https://www.daowen.com)
凡最高稀释度的溶血素可呈现完全溶血者为一个单位。依上表结果，第10管（即1∶4000倍稀释）0.5 ml溶血素为一个单位，在溶血反应中常用0.5 ml中含有2个溶血素单位的溶液，所以试验时应取1∶2000倍稀释的溶液。
表1的结果为：补体标准单位：0.3 ml补体实用单位：0.35 ml
补体两个实用单位：0.70 ml
因试验时是两个实用单位的补体0.5 ml，可依下列比例关系换算：
20∶0.7=X∶0.5 X=14.3
即需将补体稀释14.3倍，用0.5 ml则含有两个实用单位。
抗原的滴定：在用已知抗原测定未知抗体时，必须先滴定抗原效价以决定本试验时所需抗原的最适浓度（反之用已知抗体测定未知抗原时，则需滴定抗体效价）（表2）。
表2 抗原的滴定表
如血清对照管呈完全或部分不溶血是为抗补体现象。血清严重污染细菌，混有淋巴液或显著溶血时，常产生很强抗外体作用。又如试管、吸管不清洁，也可出现抗补体。若有抗补体发生，应抽血重试验。
2.补体溶血反应：
（1）取小试管4支，按下表加入各物，将上述各试管充分摇匀后，放37℃水浴箱内15～30分钟观察有无溶血现象。
（2）若红细胞溶解，则液体红色透明，为溶血反应阳性，以“+”表示；若红细胞不溶解，则液体仍呈均匀混浊或有少量红细胞沉于管底，为溶血反应阴性，以“-”表示（表3）。
表3 补体溶血反应表
