乙型肝炎重症化和乙型重型肝炎(肝衰竭)的实验室检查
白雪帆 杜虹
肝炎的实验室检查常常是辅助和确立临床诊断的重要依据，也是评估病情、进行分型、预测转归和指导治疗的重要参考。在乙型肝炎重症化的进程中，实验室检查不仅可以及时、敏感地反映肝脏的病理变化和功能状况，而且可以为临床分型评分和疗效的评估提供客观翔实的参考数据，使临床干预和救治得以顺利进行。
由于肝脏是人体内最复杂的代谢器官，涉及乙型肝炎重症化的实验室检查项目也种类繁多，通常应包括反映肝脏功能的各项生化指标、体内重要的多种氨基酸和蛋白质分子、凝血功能及其相关分子、某些免疫和炎性细胞/因子、相关的遗传学标记和其他相关的分子标志物。本节仅简述与乙型肝炎重症化和乙型重型肝炎(肝衰竭)相关的检测指标，对特异性较差的检测项目或指标可参阅其他相关书籍或文献资料。
一、肝脏功能
(一)常规肝功能检查
1.血清胆红素
虽然血清胆红素并不是肝细胞损害的灵敏指标，但其明显升高(通常大于等于正常上限值的10倍)常常是肝炎重症化或肝衰竭的特征性表现，而且是重型肝炎(肝衰竭)诊断的必备条件。乙型肝炎重症化进程中可因肝细胞损害、功能减退、胆汁分泌障碍及毛细胆管和小胆管的破裂导致胆红素代谢或排泌障碍，直接胆红素和间接胆红素均明显增加。
2.酶学检查
反映肝脏功能的酶主要有谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT，GGT)和胆碱酯酶(choline esterase，ChE)。肝脏的酶蛋白占肝脏总蛋白的2/3左右，且由于整个肝脏内的转氨酶含量约为血中含量的100倍，因此在病理情况下，只要1%的肝内酶释放入血并保持活性，便足以使血清中的酶活性增加1倍。
ALT是急性肝细胞损害时阳性率最高且增加幅度最大的酶，其在肝脏内的活性大约是血清中活性的3000倍，其活性的昼间变化较大，通常下午比清晨高。虽然ALT的检测活性高低与肝细胞受损程度大体一致，但重型肝炎(肝衰竭)肝细胞广泛坏死时此酶活性反而迅速下降，血清胆红素则显著上升，呈现“胆酶分离”现象。ALT主要存在于肝细胞细胞质内，AST在线粒体内较细胞质内多，当肝细胞坏死或细胞膜通透性改变时，ALT释出量较AST多，而当肝细胞严重损伤致线粒体受损时，AST增高更明显，以致AST/ALT值明显升高。
血清ChE主要由肝脏产生，在肝实质损害时肝脏合成此酶减少可致酶活力降低。虽然该酶在肝细胞损伤时的变化远逊于转氨酶，但在大块坏死及肝硬化肝功能失代偿时酶活力常明显下降，肝性脑病时尤为显著。
3.血浆蛋白的测定
正常人血清白蛋白的半衰期为20～26天，因此，肝脏病变时血清白蛋白的异常改变较迟，不能立即敏感地反映急性肝细胞损害特别是乙型肝炎的重症化。血清球蛋白特别是γ球蛋白仅在各类慢性肝病如失代偿性肝硬化和自身免疫性肝病时明显升高。血清前白蛋白的半衰期仅为1.9天，与血清白蛋白相比，血清前白蛋白对肝细胞受损的反应更迅速，可更早地反映肝细胞受损的情况，因此对急性进展型肝损害特别是急性和亚急性重型肝炎有特殊的诊断价值。
4.脂类检测
健康人总胆固醇由占70%的胆固醇酯和游离胆固醇构成。肝细胞发生损害时，其酯化胆固醇能力会有不同程度的下降，不仅导致胆固醇酯的构成比下降，而且可以引起总胆固醇明显降低。此外，有报道α脂蛋白在肝衰竭患者明显下降常提示预后不良。
鞘脂(sphingolipid)是机体具有重要生物活性的一种脂类，包含多种结构复杂的生物分子。鞘脂不仅是细胞膜和脂蛋白的重要成分，而且在细胞的生长、分化、迁移、自噬、死亡、信号传递和膜转运中起到重要作用。Qu F等报道采用高效液相串联质谱仪测定了52例慢性乙型肝炎(CHB)和56例HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者血清中的41种鞘脂(主要包括神经酰胺(Cer)、鞘氨醇(sphingosine)、鞘磷脂(sphingomyelin，SM))，结果表明，与健康对照组比较，CHB患者19种血清鞘脂中10种有显著差异；HBV-ACLF患者有19种鞘脂与CHB患者存在显著差异。进一步用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)法比较HBV-ACLF与CHB患者的多种鞘脂水平，发现有9项鞘脂(Cer(d18：1/20：0)、Cer(d18：1/22：0)、Cer(d18：1/24：0)、Cer(d18：1/26：0)、dhCer(d18：0/24：0)、dhSphingosine、dhSphingosine-1-P、HexCer(d18：1/24：1)、SM(d18：1/18：1))水平在两组患者间差别较大。研究还表明，二羟基神经酰胺dhCer(d18：0/24：0)单独测定，可用于预测HBV-ACLF患者3个月的生存率，其曲线下面积(AUC)为0.759(95% CI为0.624～0.893)，而MELD评分的AUC为0.732(95% CI为0.599～0.865)。如果能研制出简捷的测定试剂盒，鞘脂的测定有望用于临床。
5.血清总胆汁酸
有报道重型肝炎(肝衰竭)患者存在胆汁酸代谢异常，认为血清总胆汁酸与ALT一样是反映肝功能恢复及病情好转的敏感指标，其测定在重型肝炎(肝衰竭)病情进展的判断、疗效观察方面有重要意义。
(二)其他与肝功能相关的指标
1.血浆激肽释放酶原
Ⅻ因子(Hageman因子)经表面激活后产生相应的活化因子，能激活激肽释放酶原(kallikreinogen，又称前激肽释放酶，prekallikrein，PK)生成激肽释放酶，后者使激肽原释放出缓激肽，导致血管舒张、毛细血管通透性增加进而血压下降等。由于PK的血浆半衰期较短，肝功能障碍时其血浆含量迅速降低，因此对急性重型肝炎(肝衰竭)有重要的诊断价值。有报道称当正常对照为52%～92%时，失代偿性肝硬化存活者为24%～36%，而死亡者仅为10%～22%；当其含量降至23%以下时预后凶险，患者常于30～45天死于肝衰竭。
2.血清谷胱甘肽S-转移酶
血清谷胱甘肽S-转移酶(GST)是哺乳动物肝脏、肾小管和小肠细胞中富含的一种蛋白质，其在人体内的重要功能是与体内许多代谢性有机物(如胆红素)及胆囊造影剂环氧化物等结合而解毒。由于GST在肝细胞中含量丰富，相对分子质量小且半衰期短(仅90min)，肝细胞坏死后可迅速释放入血导致血中浓度大幅度升高，因此成为观察肝细胞坏死特别是急性肝衰竭(暴发性肝炎)的良好指标，不仅可用于肝坏死的早期诊断，也可用于判断预后。
3.载脂蛋白A-1
肝硬化合并细菌感染及其相关的脓毒症特别是内毒素血症，常常是慢加急性肝衰竭发生和加重的重要因素，由此导致的胆固醇合成减少是肝衰竭主要表现之一。而高密度脂蛋白(HDL)的减少和载脂蛋白A-1(APO A-1)的耗竭，无疑是胆固醇合成减少的重要原因。肝脏在脂类代谢中起着重要作用，不仅合成HDL和VLDL，而且可以从血液循环中摄取LDL、HDL和CM；APO A-1作为HDL的主要成分，也是在肝脏合成的。APO A-1不仅可以转移肝外多余的胆固醇至肝脏，而且可以通过蛋白-内毒素的相互作用，即HDL/APO A-1与脂多糖(LPS)结合，使LPS减少或清除，从而减弱LPS诱导的细胞因子分泌，反之多种细胞因子可以下调HDL和APO A-1的合成。随着肝纤维化的进展和肝硬化的形成，各类脂蛋白的合成也逐渐减少，低脂血症成为肝硬化患者常见的表现。Tsai M H等观察了103例合并严重脓毒症的肝硬化患者，发现非存活组患者总胆固醇、HDL、APO A-1均明显减低，与IL-6、TNF的测定值及各种肝病评分系统呈负相关，其中90天生存率在高水平APO A-1组是63.8%，而低水平APO A-1组仅8.9%。低水平的APO A-1(＜47.5mg/dL)与血清肌酐、平均动脉压一样，是预测90天死亡的独立危险因素，也与低血容量、多器官功能障碍综合征/多脏器功能衰竭密切相关。
4.肝细胞角蛋白K18及其酶解片段
大多数哺乳动物细胞含有三种细胞骨架蛋白，即微丝、微管和中间丝(intermediate filaments，IFs)，其中中间丝由组织特异性蛋白构成，其主体为细胞角蛋白(cytokeratin)，还包括波形蛋白、神经纤维细丝、核纤层蛋白等。角蛋白特异性地表达于上皮细胞，分为Ⅰ型(K9～K28，K31～K40)和Ⅱ型(K1～K8，K71～K86)，多以两型蛋白的非共价异源多聚体排列成10 nm宽的丝状体的形式存在。肝细胞内角蛋白的主要功能包括防护细胞的变形、凋亡和坏死，促进蛋白分子和细胞器在细胞内的定位并辅助部分蛋白的合成等。凋亡和坏死是各种肝病肝细胞死亡的主要形式，凋亡的激活继发于细胞外配体(ligand)如Fas配体和TNF-α与死亡受体(Fas和TNF-R1/R2)结合，最后引起半胱天冬酶的活化和许多细胞蛋白的降解，包括角蛋白，如K18被酶解后可以暴露出两个抗原表位——DALD和VEVD，应用相应的抗体建立的检测试剂盒(M30 ELISA可用于检测酶解的K18，而M65 ELISA可用于检测完整或酶解后的K18)，通过检测血清/血浆中的角蛋白片段，便可以准确甚至定量地测定凋亡的发生或区分凋亡和坏死。角蛋白变异体的存在，可导致对半胱天冬酶的抵抗，使肝细胞坏死。研究表明，急性肝衰竭(ALF)患者血液循环中有高水平的K18酶解片段，同时总的K18(用M65试剂检测)也明显增多，后者被用于替代总胆红素可以使入院时ALF患者的MELD评分预测准确度得到改善，K18酶解片段(用M30试剂检测)结合4项临床和实验室参数(肝性脑病分期、INR、总胆红素和血磷)用于ALF患者转归的判定优于MELD或KCC评分系统，曲线下面积(AUROC)分别为0.822、0.704和0.654。
Zheng S J等检测比较了33例健康对照、55例慢性乙型肝炎患者和81例HBV-ACLF患者K18片段(M30检测)和K18总蛋白(M65检测)水平，显示两种蛋白/蛋白片段均随着病型的加重而明显升高，K18片段在健康对照和慢性乙型肝炎患者中没有显著差别，但两种蛋白与HBV-ACLF患者有非常显著的差别(p＜0.001)；K18总蛋白在3组间均有非常显著的差别(p＜0.001)。此外，M30/M65值随病情加重逐渐减低(反映了HBV-ACLF患者肝细胞坏死重于凋亡)，在健康对照和慢性乙型肝炎组间差别显著(p＜0.01)，健康对照或慢性乙型肝炎组与HBV-ACLF组差别也非常显著(p＝0.003或p＜0.001)。M30和M65分别用于预测ACLF的AUC为0.80和0.87，M30/M65值在3个月存活HBV-ACLF患者和死亡/接受肝移植患者间有显著差别(p＝0.032)；在判定3个月的生存率方面，M30/M65的AUC是0.66，敏感性是52.9%，特异性是92.6%，而MELD和Child-Pugh评分的AUC分别为0.71和0.77，敏感性分别为79.4%和61.8%，特异性分别为 63.0%和88.9%。以上表明，患者M65和M30水平与肝病的轻重明显相关，M30/M65值的测定具有判定HBV-ACLF患者预后的潜在应用价值。
5.其他
如多种循环溶酶体酶、血清透明质酸盐等在肝衰竭、肝细胞坏死时也明显升高，也可用于上述疾病的监测和诊断。
二、凝血功能
HBV感染与其他病因所致的重型肝炎(肝衰竭)虽然在致病因素、发病机制和临床表现方面有所不同，但是在实验室检查方面并无明显差异。反映肝脏主要功能的蛋白质(尤其是各种凝血因子)合成与代谢解毒功能首先出现障碍，导致严重的出血和肝性脑病等。由于其本身的产生和参与凝血的环节各不相同，并非所有的凝血因子测定均适用于乙型肝炎重症化和重型肝炎的监测。
(一)凝血因子测定
1.维生素K依赖因子
维生素K依赖因子主要包括凝血酶原(Ⅱ因子)、前转化素(Ⅶ因子)、Ⅸ因子(Christmas因子)和纤维蛋白稳定因子(Ⅹ因子)。重型肝炎发病前后可因肝内外胆汁淤积、摄食减少或腹泻等多种因素导致维生素K缺乏，其中Ⅶ因子半衰期最短(4～6h)，首先受到影响，引起凝血酶原时间延长。Ⅱ因子对维生素K缺乏最不敏感，Ⅸ因子和Ⅹ因子则中度敏感。由于Ⅶ因子不仅半衰期短，而且不受其他因素(如炎症、DIC、纤维蛋白溶解等)影响，因此是判断肝脏合成功能的可靠指标，对于急性肝衰竭预后的监测也具有重要的临床价值。有报道称当Ⅶ因子低于正常对照的20%时，死亡的概率会大大增加，其预测死亡的敏感度为100%，特异性为77%。
2.人纤维介素蛋白凝血酶原酶
人纤维介素蛋白凝血酶原酶为活化巨噬细胞产生的一种炎性介质，属于纤维蛋白原超家族，可直接催化凝血酶原为有活性的凝血酶，快速启动凝血过程，促进血栓形成。研究发现，人纤维介素蛋白凝血酶原酶在乙型肝炎慢加急性肝衰竭患者的外周血单个核细胞和肝组织中均有特异性高表达，且表达水平与疾病的严重程度密切相关。
3.其他参与凝血的因子
如Ⅷ因子、Ⅺ因子、Ⅻ因子、Ⅰ因子、Ｃ蛋白、纤溶酶原水平及血小板计数等在多种临床类型的肝病中均有下降，在重型肝炎或乙型肝炎重症化进程中并无特殊变化，因此均不适于作为乙型肝炎重症化的评价指标。有学者认为，抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ，ATⅢ)、肝促凝血活酶试验(hepaplastin test，HPT)及凝血酶时间(thrombin time，TT)的联合测定，对早期诊断暴发性肝炎有重要价值。
(二)凝血功能
1.凝血酶原时间
凝血酶原时间(prothrombin time，PT)主要用于测定Ⅶ因子、Ⅹ因子、Ⅱ因子、Ⅴ因子、Ⅰ因子的活性。其结果可以有三种表示方法：一是PT延长的秒数，正常为12～16 s，比同时检测的正常对照值延长3 s为异常；二是凝血酶原活动度(prothrombin activity，PTA)，将患者的检测值代入特定公式即可算出，健康人PTA值为80%～120%，肝衰竭患者大多PTA＜40%；三是国际标准化比值(international normalized ratio，INR)，通过一定的校正系数计算患者PT与正常对照者PT的比值，大于1.2为异常，肝衰竭患者多大于1.5。PTA或INR检测值均已列入国际或国内肝衰竭的诊断标准中。
2.部分凝血活酶时间
部分凝血活酶时间(partial thromboplastin time，PTT)是内源性凝血系统的过筛试验，参与凝血活酶复合体生成的任何因子(如Ⅷ因子、Ⅸ因子、Ⅺ因子、Ⅻ因子)缺乏，或Ⅰ因子、Ⅱ因子、Ⅴ因子、Ⅹ因子减少时PTT均可延长，当抗凝物质增加时也可延长。因为多种类型肝病均可延长，因此其对肝衰竭的诊断并无特异性。
3.凝血酶时间(TT)
本试验主要测定血浆纤维蛋白原的反应性。当纤维蛋白降解产物(fibrin degradation products，FDPs)增多、纤溶活力增强，或严重肝病纤维蛋白原明显减少，或血中肝素样抗凝物质存在时，TT均可延长。
4.与纤维蛋白溶解相关的指标
除了组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)和纤溶酶原活化抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)外，其他参与纤维蛋白溶解过程的蛋白分子均在肝脏合成。因此在严重肝病如失代偿期肝硬化时纤溶酶原、α2抗纤溶酶及凝血酶激活纤溶抑制剂(TAFI)等均明显减少。相反由于肝脏清除能力下降，肝硬化时tPA的水平反有增加，而PAI-1多正常或略为增加，导致二者比例失衡，引起纤溶亢进。但在急性肝衰竭时，由于作为急性时相反应分子的PAI-1大量增加，可以导致纤溶活性下降。相反，TAFI则减少约50%，导致纤溶活性升高。
有报道血清可溶性尿激酶纤溶酶原激活剂受体(serum soluble urokinase plasminogen activator receptor，suPAR)在炎症或感染时可以明显增多。Huang Z X等观察了167例HBV-ACLF患者病程中suPAR的动态变化，发现与慢性乙型肝炎和HBV携带者比较，HBV-ACLF患者的suPAR水平明显增高，同时死亡患者的suPAR水平也明显高于存活患者(p＜0.01)。进一步分析suPAR对疾病转归的预测价值发现，在基线(入院)时如果suPAR＞16.26ng/mL，90天病死率会明显升高，而suPAR≤16.26ng/mL，则90天病死率明显降低。
尽管乙型肝炎重症化进程中或发展至重型肝炎(肝衰竭)时部分凝血因子的合成和凝血功能均可出现明显障碍，突出表现为PT延长/PTA下降/INR增高，但是近年有学者通过临床研究发现，虽然急性肝损伤(acute liver injury，ALI)/急性肝衰竭患者的平均INR为3.4±1.7，且均合并有肝性脑病，在其病程中Ⅴ因子和Ⅶ因子的血浓度也明显下降，但是其全血用血栓弹力图仪(thromboelastography，TEG)测定的平均值均正常，其中相关的5项TEG参数值在3%的患者中完全正常。笔者认为，急性肝损伤/急性肝衰竭患者之所以用TEG检测凝血功能基本正常，可能是该组患者血小板计数和纤维蛋白原定量仍保持在正常水平；此外，在急性肝损伤发生时血小板和Ⅷ因子代偿性/应激性产生增多，以及抗凝蛋白(C蛋白、S蛋白和抗凝血酶)的水平降低，也使其他凝血因子的缺陷得到了补偿。总之，INR等凝血指标虽然并不能准确地反映急性肝损伤/急性肝衰竭患者出血表现的轻重程度，但仍然是判断患者预后的有价值的指标。
三、血氨及氨基酸
(一)血氨
氨被确认为肝性脑病的促发因素已有100多年的历史了，但是直到20世纪50年代，才认定高血氨与肝性脑病有确切联系。在肝脏功能严重障碍时，尿素合成受到损害，此时脑组织常常成为体内氨解毒的主要器官。借助于谷氨酰胺合成酶，脑内星形胶质细胞可以将谷氨酸变成谷氨酰胺以清除体内蓄积的氨。由于谷氨酰胺的合成是一耗能过程，大量三磷酸腺苷的消耗，易导致能量代谢障碍。同时当高血氨致谷氨酰胺在星形胶质细胞内过量积存时，可以引起渗透压增高和脑细胞水肿，上述表现经磁共振显像已得到证实；而肝移植后随着肝脏解毒功能的恢复，原有的肝性脑病可以逆转。
急性肝衰竭患者中，当动脉血血氨浓度＞150μmol/L时，死于脑疝的风险将急剧增加。而当动脉血血氨浓度＞200μmol/L时，约有55%的患者可能出现颅内高压。Bernal W等对165例急性肝衰竭患者的研究表明，入院时动脉血血氨是发展为肝性脑病和颅内高压的独立危险因子，动脉血血氨浓度＞100μmol/L预测严重肝性脑病的准确性为70%；而与MELD评分联合可以进一步增加预测的特异性和准确性。
氨对机体的毒性是多方面的，氨的蓄积不仅可以直接或间接影响脑的代谢，损伤脑细胞的细胞器，导致脑内抑制性和兴奋性神经递质的失衡，从而损害脑的能量代谢，氨还可以改变一些维持脑功能的重要蛋白的基因表达，妨碍脑血流的自身调节，破坏血脑屏障。近年来研究还表明，氨可以损伤中性粒细胞的许多重要功能，如趋化、吞噬、脱颗粒等，并可刺激产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的发生，后者又可进一步加剧氨对脑细胞的毒性作用，引起恶性循环。
(二)血浆游离氨基酸测定
1.支链氨基酸/芳香族氨基酸值失衡
肝脏是体内分解转化各种氨基酸的重要场所，除支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)在骨骼肌代谢外，几乎所有必需氨基酸均由肝脏代谢。肝衰竭或肝硬化患者，由于肝脏对氨基酸的正常代谢受到破坏，因此绝大部分的氨基酸在血液中潴留。早在20世纪70年代，Fischer等即提出血浆氨基酸谱失衡可能是肝性脑病发生的原因，并进一步提出支链氨基酸(缬氨酸+亮氨酸+异亮氨酸)/芳香族氨基酸(苯丙氨酸+酪氨酸)值(BCAA/AAA)与肝性脑病严重程度密切相关。肝性脑病动物的血浆氨基酸分析表明，除精氨酸的浓度下降外，其余氨基酸的浓度均有显著升高。对肝性脑病患者尸体的脑匀浆分析表明，脑组织中天冬氨酸(又称天门冬氨酸、门冬氨酸)、谷氨酸和精氨酸的浓度均有显著下降，且3种氨基酸浓度的下降与肝性脑病的严重程度有良好的相关性。其余的氨基酸特别是芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸)则有不同程度的升高，这些氨基酸的浓度与肝性脑病严重程度之间有高度相关性，说明这些氨基酸在肝性脑病的发生中有重要作用，虽然并不一定起原发性的作用。蒋音等在对一组包括22例急性肝炎、65例慢性肝炎、20例重型肝炎和47例肝硬化患者的临床观察分析后指出，BCAA/AAA值在急性肝炎患者基本正常，慢性肝炎轻度患者低于急性肝炎患者(p＜0.05)，慢性肝炎重度患者显著低于慢性肝炎中度患者(p＜0.001)，重型肝炎患者或肝硬化低于慢性肝炎重度患者(p＜0.05)，各组相比，差异有显著性。在Child-Pugh分级中，BCAA/AAA值Ｃ级＜Ｂ级＜Ａ级，各组间相比，差异有显著性(p＜0.001或p＜0.02)。在重型肝炎或肝硬化中，发生肝性脑病组的BCAA/AAA值显著低于未发生肝性脑病组(p＜0.001)；死亡组的BCAA/AAA值显著低于存活组(p＜0.01或p＜0.005)。他们认为，BCAA/AAA值的测定，能够在一定程度上反映肝脏受损情况。其比值越低，肝脏受损越严重，且容易出现肝性脑病。该值对患者的预后判断也有一定的参考价值。
2.其他游离氨基酸
血浆游离色氨酸增高与肝性脑病加重相关；而在急性肝衰竭时，血浆蛋氨酸浓度明显增高，且在急性肝炎与急性肝衰竭间并无重叠，因此可用于两类肝病的鉴别诊断。
四、内毒素及中分子物质
(一)内毒素测定
内毒素(endotoxin)是由革兰阴性菌产生，存在于菌体内的一类毒素，是菌体细胞壁的组成成分。内毒素有多种生物活性，进入人体血液可造成内毒素血症，引起多种病理变化如发热、休克、DIC和粒细胞减少等，严重者也可引起急性呼吸窘迫综合征、急性肾衰竭和多器官功能障碍综合征/多器官功能衰竭等。肠源性内毒素血症是失代偿期肝硬化和肝衰竭的重要发病基础，目前认为肝硬化和肝衰竭患者内毒素血症的发生机制主要如下：①肠黏膜营养障碍，上皮细胞萎缩、脱落及溃疡形成，以致肠黏膜屏障受损；②肠黏膜充血、水肿，肠壁通透性增加；③肠道菌群失调等造成肠道中细菌移位及内毒素产生与吸收入血增多；④肠道吸收的内毒素因肝功能障碍而导致清除能力下降或由侧支循环直接进入体循环。
汪茂荣等的研究显示，肝病患者内毒素血症的发生率依次为重型肝炎64%～100%、失代偿期肝硬化46.5%～75.9%、代偿期肝硬化23.5%、急性病毒性肝炎36%。Pan C等的研究也显示，在乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭患者不同的病期，血清脂多糖(LPS)呈现动态变化，在疾病进展期为0.0168±0.0101 EU/mL，在极期为0.0960±0.0680 EU/mL，在缓解期为0.0249±0.0365 EU/mL，而对照组为 0.0201±0.0146 EU/mL。Takaya H等观察了249例各种病因导致的Child-Pugh分级为A级和B级的肝硬化患者，其中15例在平均1099天的观察期内发生了ACLF，对发生ACLF组的患者与未发生ACLF组的患者进行对比分析表明，ACLF组患者的白蛋白、PT、PLT和WBC计数均明显减低，食管静脉曲张和腹水的发生率也明显高于无ACLF组。采用半定量化学发光法对上述患者全血内毒素活性(endotoxin activity，EA)进行了测定，显示ACLF组EA平均为0.36(0.32~0.42)，无ACLF组为 0.26(0.20~0.35)，p＜0.05。将所有患者按照EA＞0.4或EA＜0.4分为两组，前一组患者AST、TBil、4COL7S(Ⅳ型胶原7S片段)均明显升高，而PT和PLT明显减低。多变量分析结果显示，Child-Pugh分级和EA测定可以独立预测ACLF的发生，曲线下面积(AUC)分别为0.848和0.763(p=0.249)，将0.4作为临界值用于预测ACLF的发生，其特异性为86.8%，敏感性为35.7%。
由上可见，内毒素血症与肝脏损害常互为因果，内毒素血症出现后肝脏损害可进一步加重。内毒素的检测对判断病情的发展和预后有着重要的指导意义。
(二)中分子物质测定
中分子物质最早发现于接受血液透析的尿毒症患者，相对分子质量为300～1500，此后逐渐确认其在肝性脑病发病中的作用。中分子物质可抑制脑细胞Na+-K+-ATP酶活性，致使Na+潴留于脑细胞，造成脑水肿。目前研究已证实，急性肝衰竭患者出现肝性脑病，血中的中分子物质增加，说明中分子物质增加与肝性脑病密切相关，对判定病情的进展及预后有一定的指导意义。
关于中分子物质的性质，目前尚未完全阐明，人体清除中分子物质主要通过肾小球滤过而排泄至体外，通过观察发现，当患者血浆肌酐浓度超过397.8μmol/L或肌酐清除率低于15mL/min时，方能测出血浆的中分子物质含量。
(三)血乳酸及降钙素原测定
乳酸是糖代谢的中间产物，乳酸浓度的高低是反映糖代谢、末梢循环及组织供血、供氧情况的间接指标，大量研究表明全血乳酸水平与危重病的严重程度和预后密切相关，血乳酸水平越高，病情越严重，疾病的预后越差。研究表明，动脉血乳酸水平对包括肝炎病毒、毒素、免疫等病因引起的肝衰竭的预测价值较低，但是对因服用过量对乙酰氨基酚引起的急性和超急性肝衰竭有较好的预测价值。但是也有学者持不同意见。例如，Schmidt L E等认为，即使在对乙酰氨基酚引起的肝衰竭，乳酸的预测特异性也不高，既不能单独作为是否需要进行肝移植的标准，对于现有的英国皇家学院标准(KCC)也无重要的价值。
降钙素原(PCT)是人类降钙素的前体物质，由116个氨基酸残基组成，相对分子质量为13000，为一种糖蛋白，无激素活性。PCT主要来源于甲状腺C细胞，在人体发生病理情况时，多种组织器官可成为PCT的生成场所，如肝、肺、肾上腺组织等。PCT的生成过程受细菌毒素和多种炎症因子的调节，而细菌毒素是诱导生成PCT的最主要刺激因子。PCT是早期诊断全身感染性炎症最为理想的指标，具有特异性强的特点。血清PCT浓度和细菌感染性炎症的严重程度呈正相关，但也可随细菌感染控制及病情好转而逐渐降至正常水平。对肝硬化腹水患者，进行血清和腹水PCT含量的测定，将有助于对合并自发性细菌性腹膜炎进行早期诊断和疗效评价。肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎的患者在给予抗生素控制感染后腹水PCT含量可显著下降，故PCT是诊断和鉴别诊断肝硬化腹水合并细菌感染的良好指标。
有报告在乙型肝炎重症化及急性肝衰竭患者伴发肠源性内毒素血症时，血乳酸和PCT水平可不同程度升高。当两者水平持续长时间不降或不断升高时，提示治疗效果不佳和预后不良。血乳酸和PCT联合检测对乙型肝炎重症化的早期预警具有一定的价值。
五、相关免疫/炎性细胞及分子
(一)调节性T淋巴细胞
CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(regulatory T cell，Treg)能够有效地抑制病理性及生理性免疫应答，在维持免疫自身耐受性和免疫内环境稳态方面发挥重要作用。Treg的分子标志物包括CD4、CD25high、CD127low、CTLA-4、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关蛋白(glucocorticoid-induced TNF receptor family-related protein，GITR)和叉头样转录因子P3(forkhead box protein P3，FoxP3)，但所有的分子标志物都不是该细胞特有的。
Treg具有抑制免疫活性细胞活化和(或)分化扩增的作用。在慢性HBV感染者，外周血和肝脏原位Treg数量和(或)功能的异常有可能造成抗HBV免疫反应异常，这可能是被感染机体针对HBV的特异性免疫反应能力低下的重要原因。Stoop等最先阐述了Treg和慢性HBV感染的关系。Xu等分别对16例AHB患者、76例AHB患者、29例慢性乙型重型肝炎患者和42例健康对照的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)及肝脏浸润性淋巴细胞中的CD4+CD25+Treg进行了分析，发现慢性乙型重型肝炎患者PBMC和肝脏浸润性淋巴细胞中的Treg均明显增加，FoxP3+细胞和炎性细胞在患者的肝脏浸润性细胞中也明显增加；在AHB患者中，外周血Treg与血清病毒载量呈明显正相关；而在AHB患者的急性期、恢复期和痊愈期外周血Treg经历了低—高—正常的过程。剔除Treg的HBV感染者PBMC受HBV抗原刺激后分泌IFN-γ的能力明显提高，而分离出的HBV感染者的Treg则可明显抑制自体PBMC对HBV抗原的增殖反应，这很可能反映了HBV感染者的外周血和肝脏中产生了HBV抗原特异性的Treg。这说明Treg不仅在调节HBV感染免疫应答中发挥了积极作用，还影响了HBV感染者的疾病预后。
(二)NK细胞和NKT淋巴细胞
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK cell)和自然杀伤T淋巴细胞(natural killer T cell，NKT cell)构成了机体防御入侵病原体的第一道防线，两种细胞在外周淋巴细胞中仅分别占13%和4%，而在肝脏中却高达37%和26%，在肝病时NK细胞的含量可高达肝内淋巴细胞的90%。它们在肝脏中的富集表明其具有重要的功能，两种细胞可以通过直接杀伤感染细胞或分泌细胞因子发挥其清除病毒的功效。
NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，不表达特异性抗原识别受体，无须抗原预先致敏就可以直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞，因此在机体抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中发挥重要作用。在病毒特异性IgG抗体存在的条件下，NK细胞也可以经表面IgGFc受体(FcγRⅢ)介导，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，识别、杀伤与IgG抗体特异性结合的病毒感染靶细胞。此外，NK细胞活化后，还可以通过分泌IFN-γ、IL-2和TNF等细胞因子发挥免疫调节作用。
NKT淋巴细胞是一类能够识别MHC-Ⅰ类分子相关的抗原呈递CD1d分子限制性的脂类和糖脂抗原的固有样T淋巴细胞，它兼具T淋巴细胞和NK细胞的表型特征(TCR和NK1.1)、Ly-49。NKT淋巴细胞有两种亚型：Ⅰ型NKT淋巴细胞，也称为恒定型NKT(invariant natural killer T，iNKT)淋巴细胞；Ⅱ型NKT淋巴细胞，也称为非恒定型NKT(non-invariant natural killer T，non-iNKT)淋巴细胞。iNKT淋巴细胞的重要特征是经TCR信号活化后可以迅速产生Th1和Th2型细胞因子，同时，经TCR信号活化的iNKT淋巴细胞也可以活化多种其他类型的细胞如DC、NK细胞、B淋巴细胞和一般的T淋巴细胞。所以说，iNKT淋巴细胞可以影响适应性免疫应答和一系列宿主防御反应和病理过程，机体内NKT淋巴细胞、NK细胞、CD8+T淋巴细胞处于一种连锁状态，在抗病毒的过程中均发挥重要作用。
Tian等认为，由于NK细胞在正常肝脏中大量存在，约占肝内淋巴细胞的1/3，在机体抗HBV感染的固有免疫应答中发挥重要作用，肝内的NK细胞可直接被病毒活化或间接被其他细胞(如NKT淋巴细胞、抗原呈递细胞等)活化，通过其天然细胞毒性和产生高水平细胞因子发挥抗病毒效应，同时可调节其他淋巴细胞(如T淋巴细胞、Ｂ淋巴细胞、抗原呈递细胞等)的功能，调控机体适应性免疫应答。CTL和NK细胞表面表达的Fas配体与肝细胞表达的Fas结合后，Fas蛋白的胞内区通过其C末端死亡结构域(death domain，DD)与Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated protein with death domain，FADD)结合，由后者激活启动半胱天冬酶导致细胞凋亡。
Malhi H等指出，在病毒性肝炎发病过程中，NK细胞和NKT淋巴细胞的作用是导致肝细胞大量死亡的一个重要因素。
(三)树突状细胞(DC)
DC是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，其既可通过分泌IL-12和IFN-α等细胞因子直接发挥抗病毒作用，也可通过抗原呈递作用诱导T淋巴细胞发挥免疫清除作用，还可以调节Th1/Th2的平衡，因而DC数量、表型及功能的异常势必会左右HBV感染的结局。
研究表明，肝内浆细胞样DC(plasmacytoid DC，pDC)和髓细胞样DC(myeloid DC，mDC)的数量在肝衰竭时明显增多；肝内pDC产生的IFN-α与IL-12、IL-10的产生有关；循环pDC产生IFN-α的能力下降，其程度与病情严重程度有关，提示在发生HBV相关的慢加急性肝衰竭时，循环血液中的DC富集到肝脏并被激活。DC激活后，抗原呈递作用明显加强，促使机体的免疫反应进入激活甚至亢奋状态。钱志平等研究发现，慢性乙型重型肝炎患者外周血DC存在成熟障碍、分泌细胞因子功能异常，尤其是介导细胞免疫的细胞因子IL-12分泌低下，同时介导炎性反应的细胞因子IL-6及TNF-α分泌亢进，可能是加剧肝脏炎症反应致重型肝炎的重要因素。
(四)Th17细胞
Th17细胞是近些年新发现的CD4+T淋巴细胞亚群，其表达的细胞因子、生物学功能及分化过程完全不同于Th1、Th2细胞。Th17细胞可通过分泌IL-17、IL-6及TNF-α等细胞因子动员、募集并活化中性粒细胞，从而有效地介导炎症反应。
Zhang等对CHB和HBV-ACLF患者外周血和肝脏内Th17细胞进行了检测，发现CHB和HBV-ACLF患者Th17细胞及其相关细胞因子升高，外周血和肝脏内Th17细胞的升高与HBV DNA载量、血清ALT水平和组织学活性指数呈显著正相关。体外试验发现，IL-17可促进pDC和单核细胞的活化，增强其分泌促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-23等的能力，提示Th17细胞可能导致CHB肝脏损伤的恶化，可作为提示乙型肝炎ACLF患者临床预后的免疫学指标之一。
Wu等发现AHB患者和重型肝炎患者外周血中Th17细胞的比例较普通慢性乙型肝炎(CHB)患者和健康志愿者显著升高。重型肝炎中Th17细胞与升高的血清ALT水平呈显著正相关，但与HBV DNA载量无相关性。另外，血清IL-10水平与Th17细胞比例呈显著负相关，提示Th17细胞与HBV疾病进程和肝脏损伤的严重程度相关。Ye等也发现，HBV感染者肝脏中分泌IL-17和分泌IFN-γ的细胞比例在Child-Pugh C级患者中显著高于Child-Pugh B级患者，在严重肝细胞损伤患者肝脏中分泌IL-17的细胞较分泌IFN-γ的细胞数量多，分泌IL-17的细胞浸润与肝脏炎症分级和肝脏内IL-8的表达、中性粒细胞浸润均呈显著正相关。Liu等发现，与乙型肝炎病毒携带者、轻中度CHB患者及健康对照者比较，重度CHB患者外周血Th17细胞的频率明显增加，Th17/Treg值也明显增高，并与肝损伤指标(ALT、AST、TBil等)的高低成正比，同时伴有IL-21、IFN-γ、IL-1β和IL-6等细胞因子或促炎因子的明显增高，表明Th17/Treg的失衡和IL-21的增高与HBV感染导致的重度肝损伤相关。Liang等的研究也显示，在肝衰竭起病时，乙型慢加急性肝衰竭(ACHBLF)组患者Th17细胞频率比CHB和健康对照组显著增加，而Treg比CHB组减少；在肝衰竭患病期，Th17细胞频率持续增高。在ACHBLF患者起病初期，Treg/Th17值及Th17细胞频率可用于判定患者的预后，在肝衰竭存活者，Treg/Th17值在病初减小，随疾病发展持续增加。
视黄酸相关的孤儿受体(retinoic acid-related orphan receptor，ROR)RORα、RORβ、RORγ是核受体的亚类，是配体依赖的转录因子，在机体许多生理功能的调节中起到重要作用，后者包括免疫、心律、胚胎发育及一些代谢过程。已知Th17细胞参与了ACHBLF的发病过程，而RORγt和RORα可以特异性地介导Th17细胞的分化，为此，Qi等对RORγt和RORα的基因表达及其在ACHBLF发病过程中的潜在作用进行了研究。观察对象为40例ACHBLF、30例CHB和20例健康对照者，采用PCR技术测定了研究对象外周血PBMC中的RORγt、RORα的mRNA，用流式细胞仪测定了Th17细胞的频数，用ELISA法测定了血清IL-6、TGF-β、IL-17、IL-23和IFN-γ。结果显示，ACHBLF患者不仅外周血Th17细胞数量比CHB和对照组明显增加，其PBMC中RORγt和RORα的mRNA、血清IL-6和TGF-β也明显高于CHB和对照组；而IFN-γ明显高于CHB患者，但低于对照组。相关分析表明，RORγt、IL-6和IL-23的数量/水平与Th17细胞数量呈正相关，而RORα、TGF-β和IFN-γ与Th17细胞无明显相关性。此外，RORγt与MELD评分也呈正相关，而RORα与MELD评分缺乏相关性。以上可见，RORγt在ACHBLF的发病中起到重要作用，可以作为疾病严重程度的候选标志物。
多种类型的免疫细胞如自然杀伤细胞，CD4+、CD8+T淋巴细胞和γδT淋巴细胞表达IL-23受体(IL-23R)，IL-23R在Th17细胞的产生和分化过程中起到重要作用，其介导的信号转导需要巨噬细胞和树突状细胞分泌的IL-23与其结合。IL-23R通过活化STAT3，促进Th17细胞的功能活化和成熟。已报道IL-23在多种自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、银屑病、炎症性肠病和克罗恩病发病中起到重要作用，与乙型肝炎的发病也有密切关系。Khanam A等测定了42例ACLF患者(其中19例系HBV-ACLF，23例为酒精相关的ACLF)、32例CHB和20例健康对照组患者的Th17细胞和IL-23R，发现ACLF患者外周血中不仅Th17细胞比另外两组明显增多，而且其比例在ACLF患者的肝内比外周血明显增高。IL-23R在ACLF患者Th17细胞的表达显著上调，既与Th17细胞的比例增高密切相关，也与CTP和MELD评分的增加相关(p值分别为0.001和0.002)。此外ACLF非存活患者的IL-23R的表达也比存活患者明显升高(p=0.01)。作者认为，同Th17细胞一样，IL-23R的高表达与肝病的炎症和疾病严重性密切关联。
(五)相关的细胞因子
1.IFN-γ
陈智教授等的研究表明，血清IFN-γ水平升高与CHB病情进展相关。IFN-γ可能参与HBV感染后的固有免疫应答和获得性免疫应答。他们认为，IFN-γ可作为潜在的生物学标志物用于监测乙型肝炎严重程度，特别是可以用于预测是否存在肝衰竭倾向。孙颖等采用免疫组化技术，分析了乙型慢加急性肝衰竭(ACHBLF)患者、慢性乙型肝炎(CHB)患者及正常对照组肝内IFN-γ的原位表达以及其分泌细胞CD4+与CD8+T淋巴细胞的数量。结果显示：ACHBLF患者IFN-γ阳性分泌细胞数明显高于CHB患者及正常对照组，p值均小于0.001；CHB患者IFN-γ阳性分泌细胞数明显高于正常对照组，p＜0.001。ACHBLF患者肝内CD4+和CD8+T淋巴细胞数量较CHB及正常对照组明显增加(p均小于0.001)，CHB患者肝内CD4+和CD8+T淋巴细胞数量较正常对照组明显增加(p均小于0.001)。肝内IFN-γ阳性分泌细胞数量与CD4+和CD8+T淋巴细胞数量均具有明显的相关性(r=0.896和0.885，p均小于0.001)。作者认为，ACHBLF患者肝内CD4+和CD8+T淋巴细胞数量的增加，其分泌的IFN-γ的增加可能参与了ACLF的发病过程。
2.TNF-α
TNF-α主要由活化的单核-巨噬细胞产生。正常情况下，它在人体内浓度很低，具有调节免疫应答等功能。持续的高水平状态会诱导肝细胞凋亡或坏死。TNF-α有两种表面受体：TNFR1和TNFR2。Du等报道，相对于亚急性暴发性肝炎、急性肝炎和健康志愿者，急性暴发性肝衰竭患者血清中的TNF-α、TNFR1及TNFR2明显升高，且TNFR1的水平在死亡患者中更高。另有报道，TNF-α、TNFR的表达水平同暴发性肝衰竭者凋亡的肝细胞数量之间有着显著正相关关系，认为TNF-α可能通过诱导Fas基因转录或其他信号转导系统而最终导致肝细胞大量凋亡。除诱导凋亡外，TNF-α还可诱导其他细胞因子(如IL-6、IL-8等)产生或释放，通过级联扩大作用促进肝内的炎症反应，加重肝细胞坏死。
3.A20
A20也称为TNF-α诱导蛋白3，是一种负性免疫调节分子，可以抑制NF-κB的信号传递。在大多数细胞中，A20的基础表达处于非常低的水平，当受到TNF、IL-1和LPS刺激时，便可以迅速地转录并过量表达，后者能够终止来自TNF受体、TLR、IL-1、NOD2受体和TCR到NF-κB的信号转导。在A20基因敲除小鼠，严重的炎症和多器官损伤可能引起小鼠幼年死亡。已有许多研究证明，A20在人类炎性和免疫性疾病发病中起到重要作用。Fan Y C等采用定量PCR技术测定了137例ACHBLF患者、105例CHB患者和35例健康对照者PBMC中的A20 mRNA，同时用ELISA法测定了上述观察对象的血浆IL-1β、IL-6和IL-10。结果显示，ACHBLF组患者A20 mRNA比CHB患者和健康对照者明显升高，而且A20 mRNA与患者的总胆红素、白蛋白、国际标准化比值(INR)、凝血酶原活动度(PTA)及MELD评分明显相关，与IL-6、IL-10水平也明显相关。分析进一步表明，将12.32定为A20 mRNA的最优界限值，可用于预测ACHBLF患者生存与死亡，其敏感性为65.7%，特异性为90.0%，阳性预测值为86.3%，阴性预测值为73.3%。作者认为，A20基因的表达上调可能参与了ACHBLF的病情发展和乙型肝炎的重症化，A20 mRNA的水平可用于判定ACHBLF患者的预后。
4.TNF-α诱导蛋白8样分子2
TNF-α诱导蛋白8样分子2(tumour necrosis factor-α-induced protein-8 like-2，TIPE2)是近年发现的维持免疫稳态的分子，为了阐明其在ACHBLF发病中的作用，Wang L Y等用RT-PCR技术测定了56例ACHBLF患者PBMC中TIPE2的mRNA，并与60例CHB患者和24例健康对照者的测定结果进行了比较。结果显示，ACHBLF患者mRNA的水平明显高于其他两组观察对象，且ACHBLF患者的mRNA水平与其血清总胆红素、INR和MELD评分呈正相关。分析还显示，死亡患者的mRNA水平明显高于生存患者，随着mRNA水平的逐渐下降，ACHBLF患者的病情也不断减轻直至康复；而死亡患者mRNA水平始终维持在较高的水平。将3组观察对象的PBMC在体外用LPS刺激后，ACHBLF患者TIPE2 mRNA的水平明显高于其他两组，而IL-6和TNF-α mRNA的水平却明显减低，并且TIPE2 mRNA的水平与TNF-α mRNA呈明显负相关。以上说明，TIPE2在ACHBLF发病中起到重要作用，有望与其他生物学指标一起作为乙型肝炎重症化的预测/预警指标。
5.IP-10
IP-10是新近发现的CXC类趋化因子，主要由IFN等诱导产生。IP-10对表达其特异性受体CXCR3的T淋巴细胞等有较强趋化功能和活化作用，在炎症反应部位对淋巴细胞的募集起重要作用，这可能是炎性细胞向肝组织定向迁移，造成大面积肝细胞坏死的重要因素。通过检测血清IP-10浓度，可间接反映肝细胞炎症反应局部IP-10的表达情况。罗亚文等研究提示，乙型重型肝炎患者血清IP-10高于CHB组，说明肝脏炎症损害程度越重，血清IP-10水平越高，故血清IP-10水平在一定程度上可反映乙型肝炎患者的炎症损害程度。
6.TRAIL-1和TRAIL-2/TRAIL-R1和TRAIL-R2系统
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是TNF-α超家族一个相对新的成员。多数研究表明，TRAIL-R2/DR5在细胞凋亡中起重要作用。TRAIL诱导的凋亡途径可能在重型肝炎发病中具有重要作用。在HBV感染者中，TRAIL受体/配体系统能特异性地杀伤病毒感染的细胞和组织。Vander Sloot A M等的研究显示，经LPS刺激培养的单核细胞产生可溶性TRAIL并作用于HepG2细胞，可引起细胞凋亡，且随着可溶性TRAIL水平升高，细胞凋亡也越明显，显示TRAIL诱导HepG2细胞凋亡呈剂量依赖性。进一步研究发现，重型肝炎患者血清可溶性TRAIL显著升高，且与血清LPS浓度以及肝脏损伤严重程度呈正相关。这可能是因为重型肝炎患者肝脏受损严重，导致体内LPS降解减少，从而刺激单核-巨噬细胞、DC等表达TRAIL增多，脱落的可溶性TRAIL也相应增多，与肝细胞上受体结合后引起正常的肝细胞凋亡，从而进一步加重病情。
7.高迁移率族蛋白1(HMGB1)
HMGB1组成型表达于所有真核细胞，在不同的物种中序列均保守。HMGB1有两个主要功能，在细胞内可以对转录进行调节，在细胞外可以促进肿瘤生长和炎症发生。已知HMGB1在细菌性炎症和脓毒血症的发病中具有重要的作用，近年发现，在类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发病过程中，HMGB1也具有重要作用。
段学章等研究发现，ACHBLF患者血清HMGB1水平高于CHB患者，前者为(10.03±3.08)μg/L，后者为(7.47+2.06)μg/L，p＜0.01。晚期ACHBLF患者血清HMGB1水平高于早期患者((11.68±1.93)μg/L和(9.11±3.15)μg/L，p＜0.01)。随访2个月后，死亡组患者的HMGB1水平高于生存组((11.03± 2.31)μg/L比对(9.52±3.01)μg/L，p＜0.05)。以上表明，ACHBLF患者血清HMGB1水平随病情进展呈进行性升高，可部分预测ACHBLF患者的预后。
8.IL-10
IL-10由Th2细胞、巨噬细胞、单核细胞、Kupffer细胞等产生，是一种抑制性细胞因子和重要的抗炎因子，主要抑制巨噬细胞的抗原呈递功能，抑制多种促炎因子产生，抑制Th1细胞应答，下调炎症反应及其瀑布效应。郑伟强等研究表明，过高水平的IL-10表达使慢性HBV感染者体内的病毒复制活跃，诱发机体过度的免疫反应。IL-10水平既可评估乙型重型肝炎的病情严重程度，又可用于判定预后。乙型重型肝炎患者合并细菌感染和重叠其他肝炎病毒感染时血清IL-10水平明显降低，说明内毒素血症及双重病毒感染在促进重型肝炎发展中起到重要的作用。
顾静等的观察表明，HBV-ACLF组患者病程中IL-10水平显著高于CHB对照组，且HBV-ACLF组患者的IL-10水平在病程早期低于中期，中期低于晚期(p值均小于0.05)；同时存活组IL-10水平高于死亡组(p=0.038)。作者分析认为，HBV-ACLF发病时机体超强免疫反应启动，负性调控因子IL-10为维持机体免疫平衡而被动性增多，随着病情进展，促炎因子(IL-32等)水平逐渐下降，而IL-10水平则逐渐上升，提示HBV-ACLF患者早期以促炎因子分泌为主，随着病情进展，促炎因子分泌减少，抗炎因子分泌增多，出现“免疫麻痹”现象。而存活组体内IL-10水平明显高于死亡组，提示存活组体内抗炎反应居优势地位，机体炎症反应减轻，有利于疾病缓解和康复。
研究者发现，在急性肝衰竭(ALF)患者中，高水平的IL-10与单核细胞的功能障碍及不良预后有关。为了探索IL-10启动子区变异对IL-10的产生及对炎性疾病易感性的影响，Yan Z等调查了345例中国HBV相关ALF(HBV-ALF)患者IL-10启动子区三种单核苷酸多态性(SNP)类型的变异(A-1082G，T-819C，A-592C)情况，并与414例健康人群和367例无症状的HBV携带者进行对比观察。研究发现，HBV-ALF患者-592C和-819C变异的频率远高于健康人群和HBV携带者，且IL-10启动子区-1082G-819C-592C单倍型(haplotype)的HBV携带者发生ALF的可能性也明显增加。进一步的功能学研究表明，A-592C是一核蛋白结合部位，单核细胞分泌IL-10的增加与变异的-592C等位基因型转录活性明显高于-592A等位基因型有关。在欧美人群，占优势的GCC单倍型患者其IL-10的分泌远高于ACC和ATA单倍型，但是东亚国家或地区GCC单倍型很少，说明其对HBV-ALF的发生影响有限。作者指出，IL-10的产生在HBV-ALF病程中呈现双相反应，早期升高是继发于促炎因子的大量释放，后期则多伴发于终末期患者的内毒素血症，导致单核细胞功能的钝化。
戚朝霞等采用甲基化特异性PCR(MSP)技术测定了ACHBLF和CHB患者PBMC中的IL-10启动子甲基化状态，并与健康对照者进行了比较。结果显示：①ACHBLF组完全甲基化率为4％(1/25)，未甲基化率为84%(21/25)，甲基化与未甲基化共存率为12%(3/25)。CHB 组完全甲基化率为12%(3/25)，未甲基化率为44%(11/25)，甲基化与未甲基化共存率为44%(11/25)。健康对照组完全甲基化率为20%(2/10)，未甲基化率为20%(2/10)，甲基化与未甲基化共存率为60%(6/10)。②ACHBLF 组甲基化分布状态较CHB 组和正常对照组差异有统计学意义(p＜0.05)，而CHB 组较健康对照组差异无统计学意义(p＞0.05)。③血清IL-10含量与甲基化状态呈明显负相关(r=-0.878，p＜0.05)。以上提示IL-10基因启动子区的甲基化可能参与ACHBLF的发病过程，是IL-10水平变化的原因之一，但不是主要的影响因素。
9.IL-21
IL-21是一种多功能、多效性的细胞因子，主要由活化的CD4+T淋巴细胞、NK细胞合成分泌，可调节T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和DC的分化和增殖，参与固有免疫应答和适应性免疫应答。潘兴飞等用ELISA检测了60例ACLF患者(重肝组)及18名健康人(对照组)血清中IL-21蛋白，并与患者的主要肝功能指标进行相关性分析。结果显示，重肝组患者外周血IL-21表达高于对照组，两组之间的差异有统计学意义(p＜0.05)；IL-21水平与ALT、AST、TBil呈正相关(p＜0.05)，与ALB呈负相关(p＜0.05)。以上表明，IL-21表达增高，与肝脏的炎症和损伤程度相关，可能参与ACLF的发病，并可作为判断肝脏炎症程度的指标。石荣亚等用ELISA方法检测了36例ACHBLF、29例失代偿性乙型肝炎肝硬化(LC-d)、12例代偿性肝硬化(LC-c)、31例轻度慢性乙型肝炎(CHB-c)、51例中度CHB(CHB-m)、7例重度CHB(CHB-s)及10例健康对照者(Ht-c)血清中IL-21，结果(以OD值表示)依次为539.57±238.18、149.74±38.13、160.91±45.64、253.45±79.79、298.21±69.17、332.85±332.85和53.6±22.88，其中ACHBLF、LC-d、LC-c、CHB-s与对照组比较，差异非常显著(p＜0.01)，CHB-c、CHB-m与对照组比较，差异显著(p＜0.05)。同时测定的IFN-γ结果也类似。IL-21与患者的ALT和MELD评分均呈正相关，但ACHBLF组死亡与存活患者的IL-21比较没有明显差异。作者认为，IL-21在HBV感染后肝细胞损伤中起一定作用，可在一定程度上反映肝细胞损伤的严重程度，提示IL-21产生过多可能是HBV感染患者肝细胞受损的重要机制之一。
10.IL-22
IL-22是Th17细胞分泌的主要因子之一，属于IL-10细胞因子家族成员，Th17细胞是分泌IL-22的主要细胞之一，CD4+T淋巴细胞亚群中活化的Th1细胞、Th22细胞及固有免疫细胞，以及γδT淋巴细胞、NKT淋巴细胞、淋巴组织诱导(lymphoid tissue inducer，LTi)细胞、LTi样细胞和NK22细胞也分泌IL-22。IL-22受体是由IL-22R和IL-10Rβ链组成的异源二聚体，主要表达于组织器官，如肝细胞、胃肠道和皮肤的上皮细胞，但是在免疫细胞中并无表达。已证明IL-22在肝脏和其他组织中具有免疫调节和免疫保护的特性。IL-22可诱导促炎基因的表达，但其也具有促进肝细胞分裂增殖、抑制肝细胞凋亡的作用。因此，Th17细胞和IL-22可能在HBV感染的免疫应答中发挥多重作用。
Zhang等对HBV感染者外周血中Th17细胞的比例和IL-22的表达水平进行了检测，进一步应用HBV转基因小鼠检测了IL-22诱导的抗病毒效能、肝脏炎症及炎性细胞向肝脏的趋化和浸润等。结果发现，急性乙型肝炎患者外周血中Th17细胞的比例和IL-22的表达较健康志愿者显著升高。IL-22在抗原非特异性细胞向肝脏的趋化募集，增强CTL介导的肝脏损伤中发挥重要作用。但是，IL-22并不能在体内直接有效地抑制HBV复制。将HBV免疫小鼠的脾细胞过继性转移至HBV转基因小鼠体内所导致的继发性肝细胞损伤程度可通过中和IL-22得以改善，中和IL-22可显著抑制抗原非特异性炎性细胞向肝脏的趋化、募集和浸润。
莫瑞东等用ELISA方法测定了79例ACLF患者和24例健康志愿者血浆IL-22水平。结果显示，ACLF患者血浆IL-22基线水平为(32.9±17.8)pg/mL，显著高于健康对照组的(15.1±8.5)pg/mL，p＜0.01。在观察第28天时ACLF未存活组患者血浆IL-22基线水平为(35.2±20.2)pg/mL，明显高于存活组的(30.9±10.2)pg/mL，p＝0.031，且至第28天时仍维持在高水平的(38.8±18.2)pg/mL，p＝0.739，而存活组则降至(26.2±6.6)pg/mL，p＝0.044。MELD评分大于26分的患者血浆IL-22为(40.1±6.8)pg/mL，MELD评分不高于20分患者的血浆IL-22为(29.2±1.4)pg/mL，p＝0.04。以上表明，IL-22在ACLF患者血浆中表达明显升高，且其水平与患者预后和相关疾病转归相关，提示血浆IL-22有望作为判断ACLF患者预后和疾病转归的预测因子。
11.IL-23受体
IL-23是IL-12细胞因子家族成员，由IL-12p40和IL-23p19亚基组成，与IL-12共用IL-12 p40亚基。IL-23能直接作用于T淋巴细胞使其产生IFN-γ、IL-17等炎症因子，通过活化DC来活化和调节T淋巴细胞依赖的免疫应答，IL-23在自身免疫性疾病的发生、发展及转归过程中也起到关键作用。IL-23R也是由IL-2Rβ2和IL-23组成的异源二聚体，在IL-23与其结合后可以经STAT3介导相关的信号传递，在Th17细胞的生长、成熟、分化和功能活化中起到重要作用。为了了解IL-23R在ACLF发病中的作用，Khanam A等应用流式细胞仪和多种标记抗体测定了42例ACLF(其中19例为HBV-ACLF、23例为酒精相关的ACLF)、32例CHB和20例健康对照者外周血各种CD4+CD17A+Th17细胞及多种细胞因子，结果显示：①与CHB和健康对照组相比，ACLF组患者循环Th17细胞明显增加(p=0.03，p=0.006)，而且ACLF患者肝内Th17细胞的比例高于外周血；②IL-23R在ACLF患者Th17细胞的表达显著上调，而且与患者肝脏炎症及疾病的严重程度的相关指标如血清胆红素、Child-Pugh评分、MELD评分、血肌酐和INR密切相关(p＜0.05)；③ACLF非存活者与存活者比较，IL-23R的表达明显增高，p＝0.01。以上表明，ACLF患者Th17细胞表面IL-23R的高表达与肝脏炎症的诱导及疾病的严重性密切相关。
12.IL-32
IL-32是一种新发现的促炎细胞因子，主要由T淋巴细胞、NK细胞、上皮细胞分泌，可通过激活NF-κB、AP-1和p38 MAPK等通路诱导IL-1β、TNF-α、IL-6等细胞因子的表达。业已发现，IL-32作为促炎因子在风湿性关节炎、炎症性肠病、特异性皮炎、胰腺炎、CHB、慢性丙型肝炎等自身免疫性和炎症性疾病的发生、发展中起重要作用。邹勇等采用ELISA和免疫组织化学方法，对20例接受肝移植治疗的HBV-ACLF患者、20例轻度CHB患者和5例接受血管瘤手术切除的患者(作为正常对照)的血清和肝组织IL-32进行了检测。结果显示，HBV-ACLF患者外周血血清IL-32水平平均为(836.7±229.7)ng/L，轻度CHB患者血清IL-32水平为(186.2±38.6)ng/L，正常对照者血清IL-32水平为(71.2±9.2)ng/L，HBV-ACLF患者血清IL-32水平明显高于轻度CHB患者和正常对照者(两两比较p值均小于0.001)。HBV-ACLF患者肝组织中IL-32的表达水平为(176.3±36.9)ng/L，轻度CHB患者为(32.6±7.6)ng/L，正常对照者为(15.3±5.7)ng/L，HBV-ACLF组与轻度CHB和正常对照组比较p值均小于0.001。相关性分析表明，HBV-ACLF和轻度CHB组患者血清和肝组织中IL-32的水平均与肝功能中总胆红素的高低呈正相关(r分别为0.686和0.544，p值均小于0.05)。从上可见，IL-32高表达可能是导致HBV-ACLF免疫性肝损伤加剧、肝细胞大量凋亡和坏死的重要因素。
前已述及，顾静等在观察HBV-ACLF患者、CHB患者及健康对照者血清IL-10的同时，也动态监测了血清IL-32的水平变化。结果显示，HBV-ACLF组IL-32水平为(500.98±152.33)pg/mL，显著高于CHB组的(281.72±99.28)pg/mL及健康对照组的(178.16±50.54)pg/mL(p值均小于0.05)。动态监测HBV-ACLF组IL-32水平显示，ACLF早期高于中期((540.69±155.71)pg/mL vs. (498.43±135.56)pg/mL，p＜0.05)，中期高于晚期((498.43±135.56)pg/mL vs. (450.77±102.33)pg/mL，p＜0.05)。HBV-ACLF感染组IL-32水平高于非感染组((553.41±158.65)pg/mL vs.(482.54±110.16)pg/mL，p=0.021)；HBV-ACLF存活组IL-32水平低于死亡组((481.95±100.67)pg/mL vs.(540.62±112.45)pg/mL，p=0.011)，存活组IL-10水平高于死亡组((4.21±1.27)pg/mL vs.(3.61±1.05)pg/mL，p=0.038)。作者认为，IL-32及IL-10参与了HBV-ACLF疾病的发病过程，动态监测其水平有助于判断预后。
13.IL-33
作为IL-1家族的新成员，IL-33是一种多功能的细胞因子。IL-33在体内以两种形式存在，一是其前体，全长的IL-33，主要在上皮细胞或内皮细胞核内组成性表达；当细胞坏死和凋亡时，前体IL-33可以经非常规途径释放出来，经丝氨酸蛋白酶水解后生成具有较高生物学活性的成熟的细胞因子，并大量地与其受体ST2结合，生成IL-33-ST2复合物，激活多种细胞内信号通路发挥其生物学效应——介导Th2型免疫，与过敏性疾病、纤维化生成及驱除蠕虫感染相关；促进Th1型免疫和CD8+T淋巴细胞应答，产生抗病毒、抗肿瘤的保护作用。已发现IL-33/ST2还参与了病毒性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌的发病过程，为此，谢青教授等测定了51例HBV-ACLF患者血清中IL-33和可溶性ST2(sST2)，并与健康对照和CHB组患者进行对比，发现在病后第1周末IL-33水平在各组间无明显差别，而sST2差异显著，HBV-ACLF组最高，且存活ACLF患者第4周末sST2水平明显下降，而非存活患者仍维持较高的水平。此外，血清sST2与多项实验室指标和预后评分显著相关，证明sST2可用于预测HBV-ACLF患者的半年病死率。
14.IL-35
IL-35是目前唯一发现的由调节性T淋巴细胞分泌的抑制性细胞因子，其结构为由EBl3和IL-12 p35两个亚基构成的异源二聚体，属于IL-12家族成员。作为免疫抑制性细胞因子，IL-35被发现与众多自身免疫性疾病密切相关，在感染性疾病中亦具有重要的作用。
陈丽等用ELISA法分别检测28例HBV-ACLF患者、28例CHB患者及28例正常人血清IL-35水平及各项临床指标。结果：血清IL-35浓度(pg/mL)在正常组、CHB组和ACLF组分别为178.26±52.32、426.83±236.29、1087.00±436.26，ACLF组明显高于其他两组，3组间比较差异有统计学意义(F=9.95，p＜0.01)；同时观察HBV-ACLF患者病程早、中、晚期血清IL-35变化，ACLF早、中、晚期血清IL-35浓度(pg/mL)分别为1539.00±285.72、1082.94±333.90、636.80±169.00，各期比较差异有统计学意义(F=3.81，p=0.018)。比较ACLF存活组与非存活组患者血清IL-35水平的差异，两组IL-35浓度(pg/mL)分别为1472.94±308.02、1544.36±274.84，差异无统计学意义(p=0.65)。将IL-35与ALT、AST的检测结果进行相关性分析，ACLF早期IL-35与ALT具有相关性(p＝0.02)，而中、晚期无明显相关性(p＞0.05)。作者认为，HBV-ACLF患者病程中血清IL-35明显升高，且在疾病早期升高，中晚期降低；早期IL-35与ALT呈正相关，说明IL-35的升高可能部分反映患者免疫功能状态和预后。
(六)骨桥蛋白
骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是1979年发现的一种包含精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸(RGD)整合素结合区的分泌性磷酸化糖蛋白，1983年被Herring从骨基质中分离出来而得名。研究发现，OPN是免疫细胞募集及启动Th1细胞免疫的关键细胞因子，参与了许多炎症反应的病理过程。研究证实NKT淋巴细胞能分泌OPN，OPN能放大NKT淋巴细胞的激活作用，触发中性粒细胞浸润及活化。进一步研究OPN在肝炎中的发病机制发现，在OPN转基因鼠，给予伴刀豆球蛋白A后，肝脏大片坏死，单核细胞浸润，而对照组给予同样处理后，只是轻微的肝脏损伤，故推测OPN可能引起Th1/Th2免疫平衡失调，诱发大片肝坏死。相关研究还显示，慢性乙型重型肝炎患者外周血OPN水平明显升高。在暴发性肝炎中，OPN升高更为显著，推测OPN是以自分泌方式，通过启动Th1细胞因子网络IL-18、IFN-γ的作用，引起单核-巨噬细胞活化，进一步引起大片肝坏死。近期，Liu L G等进行了慢加急性肝衰竭(ACLF)患者OPN与90天病死率的相关性研究，发现与CHB组和健康对照组比较，ACLF患者血清OPN明显增高(p＜0.01)，ACLF死亡患者的OPN水平也明显高于生存患者。此外，还发现ACLF患者的血清OPN水平与总胆红素、MELD评分呈正相关。按照OPN的高低分为3组，其中低水平组血清OPN＜6135ng/mL，中等水平组为6135～9043ng/mL，高水平组＞9043ng/mL，3组患者的病死率分别为27.78%、52.94%和73.68%。血清OPN是预测ACLF的独立危险因素。
(七)模式识别受体
Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR-4)作为内毒素的特异性受体，通过识别血清内毒素，与LPS/LBP/CD14结合，招募髓样分化因子88(myeloid differentiation factor-88，MyD88)，激活IRAK(IL-1R相关激酶)及MAPKK(MAPK kinase)家族，最终诱导NF-κB活化，从而激活靶基因转录，释放一系列细胞因子，造成肝细胞损伤。重型肝炎患者由于肠道菌群紊乱和细菌过度生长以及胃肠道黏膜淤血，肠道产生、吸收内毒素增加，同时由于肝细胞大量坏死，免疫功能下降，Kupffer细胞清除能力下降，因而对内毒素及内毒素免疫复合物的清除减少，导致内毒素血症。
LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，有着重要的病理生理功能。TLR-4是LPS信号转导的关键受体。调控TLR-4的表达有可能控制LPS有关的炎症反应。Xu等设计并构建了TLR-4 siRNA表达载体，通过转染鼠巨噬细胞系RAW264.7评估其基因沉默效率，进一步在小鼠肝损害模型中评价TLR-4基因沉默的治疗效果。结果显示，RAW264.7细胞中TLR-4 mRNA及蛋白水平均明显降低；TLR-4 siRNA明显抑制LPS对TNF-α及巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)2表达的上调作用，LPS对p38-MAPK及ERK1/2的活化作用亦被TLR-4 siRNA显著下调。进一步研究证明，TLR-4 siRNA预处理有助于控制LPS炎症反应，明显减轻D-GalN/LPS对C57BL/6小鼠的肝损害作用，降低急性肝损伤小鼠的死亡率。
研究发现，CHB患者PBMC表面TLR-4蛋白及mRNA水平明显高于正常人，而慢性乙型重型肝炎患者的TLR-4水平又显著高于CHB患者，提示在HBV感染引起的肝损伤过程中，TLR-4均发挥了作用，且随着疾病的进展其表达明显增加，与疾病的发生、发展密切相关。范建高等发现TLR-4的表达量随内毒素血症程度的增高和刺激时间延长而增加，且LPS能正性上调TLR-4表达，进一步放大了LPS的生物学效应。因而在乙型重型肝炎中，肝细胞大量坏死，肝Kupffer细胞灭活能力减弱，进一步加速了内毒素血症的发生，而内毒素通过影响肝细胞代谢或TLR-4介导的免疫反应加重病情的恶化，两者相互影响，互为因果。
以上研究表明，CHB特别是乙型重型肝炎患者PBMC表面TLR-4水平显著升高，监测TLR-4值的动态变化有助于指导治疗。
(八)诱导型一氧化氮合成酶
一氧化氮是一种半衰期极短的生物调节因子，通过一氧化氮合成酶催化L-精氨酸生成，具有广泛的生物学功能。目前研究认为，一氧化氮具有潜在的抗病毒诱导活性，而且可能是肝脏损害的介导因子之一。对诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)缺陷型小鼠模型的研究发现，该小鼠模型由于一氧化氮合成障碍，可耐受CTL在抑制病毒复制过程中可能造成的免疫损伤，也可以对抗致死量的抗Fas抗体注射，使其免于因注射抗Fas抗体而引起的肝坏死，并且无肝损伤表现。在重型肝炎患者血清中一氧化氮水平显著升高，若体内炎症反应逐渐减轻，肝功能好转，病情进入恢复期，一氧化氮水平又大幅下降。这些研究均说明一氧化氮与肝内炎症程度、病情严重程度密切相关，在重型肝炎发病中起一定作用。
研究表明iNOS基因与病毒性肝炎有密切关系，正常肝细胞中iNOS基因表达量极低，一旦病毒侵入肝细胞后就会诱导肝细胞激活iNOS基因并使其表达，产生大量的一氧化氮。一方面可以杀伤病毒、细菌、寄生虫等病原体和肝肿瘤细胞，发挥广谱抗病毒和抗肿瘤功能；另一方面可通过细胞毒作用损伤正常肝组织，造成肝细胞死亡。郭风劲等研究认为，HBV感染后，pre-S2蛋白通过其反式调节作用，下调iNOS的转录活性，进而导致一氧化氮产生减少，从而阻断肝细胞通过一氧化氮的产生清除感染肝细胞HBV的作用，实现长期慢性感染。由此，iNOS的表达可以作为炎症损伤的衡量因子。
(九)中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是Kjeldsen等于1993年研究中性粒细胞内基质金属蛋白酶9时，发现的一种新的肌钙蛋白样的生物标志物。目前普遍认为，NGAL可用于急性肾损伤/急性肾衰竭的监测。
肾功能异常或障碍在失代偿性肝硬化和肝衰竭等重型肝炎病程中极为常见，其中发生急性肾衰竭时肌酐水平可迅速上升，易于检测，而并发慢性肾损伤时往往不易检测和诊断，常用的各种基于肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)的诊断需要测定各类物质的清除率，但该类技术比较复杂，并不适于临床常规应用。肌酐的测定简单易行，但已有报道对于肝硬化基础上并发的肾损伤测定肌酐并不准确，为此，Gerbes A L等观察了22例血清肌酐水平始终低于1.5mg/dL的肝硬化腹水患者，比较分析了血清NGAL与肌酐的测定结果。22例患者分为两组，第1组共16例患者，通过51Cr-EDTA技术测定的GRF平均为(69±15)mL/min，而第2组患者测得的GRF为(29±10)mL/min，两组患者的肌酐水平分别为(0.8±0.2)mg/dL和(1.1±0.3)mg/dL，无显著性差异；通过血清肌酐测定值估算的GRF值分别为(106±34)mL/min和(65±17)mL/min，也无显著性差异；而NGAL的测定值分别为(50±15)ng/mL和(136±61)ng/mL，两组比较差异非常显著(p＜0.01)。尿液中NGAL的测定结果与血液测定类似，其中第2组中的5位患者尿NGAL＞100ng/mL。曲线下面积(AUC)分析也显示当用于鉴定GRF＜50mL/min的患者时，NGAL明显优于肌酐测定，前者的AUC为0.98(0.96～1.00)，后者为0.79(0.66～0.92)，p＜0.05。
近年研究发现，NGAL不仅可用于急性肾损伤/急性肾衰竭的监测，还是ACLF及其预后相关的生物学标志物，与肝衰竭和全身性炎症密切相关。Ariza X等测定了716例因各种肝硬化并发症住院患者的血浆NGAL和尿NGAL，其中148例(20.7%)合并ACLF，其余568例均为失代偿肝硬化。结果显示，ACLF患者的血浆和尿NGAL比没有发生肝衰竭的患者明显升高，其中血浆NGAL在两组分别为232(147～422)ng/mL和131(99～187)ng/mL，尿NGAL分别为108(35～400)μg/g肌酐和29(12～73)μg/g肌酐，p值均小于0.001。尿NGAL也同MELD评分一样，可以独立预测28天无肝移植ACLF患者的病死率。此外，还观察到NGAL的基因LCN2在ACLF患者的表达明显上调，并且直接与血清胆红素、INR、MELD评分及IL-6相关。
(十)巨噬细胞炎性蛋白
巨噬细胞炎性蛋白(MIP)是1988年Wolpe等首次发现的一种新的蛋白质，可分为MIP-1、MIP-2、MIP-3、MIP-4、MIP-5共5种亚型。MIP-2具有肝素的结合位点，可与内皮细胞外基质中肝素硫酸葡聚糖相互作用，加强白细胞与血管内皮细胞的黏附。MIP-2通过对炎性细胞的化学趋化和活化作用而参与炎症的全过程，其特异性靶细胞为中性粒细胞，可特异性趋化和激活中性粒细胞，目前普遍认为MIP-2是炎症早期重要的促炎细胞因子。
陈智报道MIP-2在乙型重型肝炎患者血清中水平显著高于其他组，如果患者该指标持续增高，可预警乙型肝炎重症化的发生，并可用于监测乙型肝炎患者病情轻重。
(十一)胸腺素β4
胸腺素β4(thymosin β4，Tβ4)是人体内主要的肌动蛋白调节分子之一。它可以与球状肌动蛋白(globular actin，G-actin)结合，抑制纤维状肌动蛋白(fibrous actin，F-actin)的生成，从而减少肝衰竭患者小血栓的形成及微循环功能障碍的发生，进而阻止患者多器官功能衰竭的发生及发展。Tβ4还能降低自由基水平，减缓脂质过氧化，抑制促炎细胞因子的生成。肝衰竭时常伴有大量单核-巨噬细胞浸润，分泌、释放促炎细胞因子，加重全身炎症反应。刘莹等研究发现，肝衰竭患者血Tβ4含量明显低于肝硬化组、慢性乙型肝炎组及正常对照组。血清Tβ4动态变化水平可作为判断肝衰竭预后情况的参考指标。
(十二)T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3
T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin mucin 3，Tim-3)是2002年发现的一种与T淋巴细胞功能有关的表面分子。对小鼠动物模型的研究发现，Tim-3作为一种负调节分子选择性表达在活化的Th1细胞表面，Tim-3与其配体的相互作用在Th1细胞介导的免疫应答中起负调节作用。Sabatos C A等研究发现在CHB患者外周血中Tim-3的表达明显增加，说明机体在乙型肝炎的慢性期可能通过调控Treg活性等机制来诱导Tim-3的表达从而抑制特异性的Th1细胞应答。
邹晓清等研究发现乙型重型肝炎患者血清中Tim-3水平显著高于其他组，可用于监测乙型肝炎患者病情轻重。随着CHB病情的进展，患者血清中iNOS与NGAL表达均逐渐增加，在CHB重度组患者达到最高峰，而在乙型重型肝炎患者血清中又有所降低，可用于预警乙型肝炎重症化。有报道Tim-3和MIP-2持续升高而iNOS和NGAL开始回落的相交点对预警乙型肝炎重症化具有重要的临床意义。
(十三)Caspase-1的表达及其与慢加急性肝衰竭的关系
炎症小体是近年发现的涉及人体天然免疫的一种多蛋白复合物，可以识别PAMPs/DAMPs，募集和活化半胱天冬酶即caspase-1，酶解IL-1β和IL-18的前体，产生成熟的细胞因子，并诱导细胞焦亡和后续的细胞裂解和炎症。半胱天冬酶不仅可以介导炎症发生，而且可以介导Fas相关的肝细胞凋亡和TNF-α诱导的肝细胞损伤。Zhang X Y等从蛋白和基因水平，检测了126例HBV-ACLF患者血清和肝组织中的半胱天冬酶。结果表明：与CHB、乙型肝炎肝硬化和乙型肝炎相关的肝细胞肝癌患者比较，ACLF患者肝组织中半胱天冬酶的mRNA和蛋白的检出水平均明显降低，而外周血中此酶的水平却明显升高，推测半胱天冬酶在ACLF患者病程早、中期表达增强。进一步比较30例存活的ACLF患者与41例病故患者的血清半胱天冬酶水平，后者比前者明显减低：两组患者的动态测定表明，随着病程进展，两组患者的酶水平均逐渐下降，但存活组随着病情缓解后酶的水平出现明显上升反弹，而死亡组患者则持续下降至极低的水平。作者应用血清半胱天冬酶构建曲线下面积(AUC)为0.89(95% CI为0.76～0.90，p＜0.0001)，敏感性为80.95%，特异性为87.13%。当用于ACLF的预后分析时，与MELD评分比较，血清半胱天冬酶的AUC为0.81，而MELD仅为0.67。作者相信，血清半胱天冬酶有望成为评估ACLF病情和判定预后的新的生物学标志物。
(十四)细胞外组蛋白
急性肝衰竭(ALF)或ACLF导致的大量坏死的肝细胞可以释放出许多炎症因子，包括细胞外组蛋白(cellularhistone)，这一现象不仅在ConA和对乙酰氨基酚制备的肝衰竭动物模型上观察到，也已在HBV感染相关的ALF、ACLF患者中得到印证。Li X等对比观察了112例HBV-ACLF、90例CHB、80例乙型肝炎肝硬化患者和40例健康对照者的血浆组蛋白H4，证实ACLF患者病程中组蛋白水平明显增高，增高程度与炎症反应的强弱、病情轻重和转归明显相关。体外细胞模型实验表明，应用抗组蛋白H4抗体可以显著抑制炎症因子的释放和组蛋白带来的促炎效应。作者认为，细胞外组蛋白可以直接或间接加剧细胞损伤和全身性炎症反应，从而加重ACLF患者的病情，靶向细胞外组蛋白的治疗或许有助于肝衰竭患者的康复。
六、相关遗传学标记
(一)性激素通路与乙型肝炎重症化
近年研究发现，性激素受体基因的遗传变异在乙型肝炎重症化患者和HBV携带者之间存在明显差异，由此可以解释乙型肝炎患者病情进展中性别的差异。临床观察发现，男性HBV感染者有较高的发病率和慢性化率，男性慢性HBV感染者有较高的活动频率，由此说明性激素及其受体可能通过调节宿主免疫反应和病毒复制水平影响HBV的感染过程。目前认为，清除病毒的免疫反应可能下调雄激素和上调雌激素。性甾体激素可能通过雄激素受体介导调节HBV的复制。有研究证明，雄激素对细胞免疫反应和体液免疫反应均产生抑制作用，雌激素对细胞免疫反应产生抑制而对体液免疫反应产生增强作用，孕激素则促进细胞免疫反应向体液免疫反应转化。
雌激素受体(estrogen receptor，ESR)在其他多基因遗传病中的作用已有较多报道，在HBV感染中的作用也很早就受到遗传学家和病毒研究者的关注。众多研究表明，ESR在持续性HBV感染中发挥重要的调节作用，ESR基因与乙型肝炎宿主遗传易感性相关。HBV携带者表达低水平ESR，导致免疫系统对性激素的反应不足，从而造成机体对HBV清除不力而更容易引起HBV持续性感染。人ESR可分为两类，即雌激素受体A(ESR1)和雌激素受体B(ESR2)，无论ESR1还是ESR2的遗传变异都会导致雌激素功能的下降，从而有可能导致对HBV感染形成不同类型的宿主遗传易感性。其中ESR1基因有功能意义的突变，更容易导致雌激素抵抗，雌激素主要是通过与ESR1结合来发挥其作用的，ESR1基因才是真正对HBV感染具有宿主遗传易感性的微效基因。国内邓国宏教授等通过大样本对ESR1基因多态性与慢性持续性HBV感染之间的关系进行了研究。他们发现ESR1 29T/T基因型的个体与至少含一个29C等位点的个体相比持续HBV感染的易感性显著增加(p＜0.001)。连锁不平衡作图分析表明T29C多态性包含了位于ESR1启动子到内含子3的一个连锁不平衡区域，这表明检测到的ESR1 T29C转换来源于ESR1本身，中国人群中ESR1基因多态性与HBV持续感染显著相关。
正常男性下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈调节，主要由血清睾酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)通过中枢神经系统反馈来调节下丘脑活动，控制垂体释放黄体生成素(luteinizinghormone，LH)和卵泡刺激素(follicle stimulatinghormone，FSH)。相关研究发现，男性乙型肝炎肝硬化患者血清T和E2水平降低，血清LH和FSH水平相应增高，提示肝功能受损可能是导致患者性激素和垂体激素异常的重要原因。目前关于乙型肝炎急性活动期及重型肝炎患者的性激素与垂体激素变化的研究尚少，但可以肯定的是，准确监测CHB患者性激素及相关的垂体激素变化，可在一定程度上反映肝脏损害的程度，并可作为乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝硬化并发肝癌追踪和观察疾病进程的有用指标之一。
(二)抗病毒免疫反应基因与乙型肝炎重症化
目前认为，重型肝炎发生、发展的“启动或控制点”受病毒(如病毒变异、病毒蛋白、病毒基因型等)和宿主(如细胞免疫、细胞因子、细胞凋亡等)两个方面因素的影响，其中病毒复制是重型肝炎发生和发展的必需条件和病因所在。研究表明在重型肝炎发病早期，常存在较活跃的病毒复制，提示病毒因素在乙型肝炎重症化的发生、发展过程中占据重要地位。宿主转录因子的改变、HBV基因变异等都有可能导致HBV转录复制水平的改变而致乙型肝炎重症化。
肝富集转录因子(liver-enriched transcription factor，LETF)是一类具有基因转录调控作用的蛋白质分子，主要存在于肝脏。Long C E等的研究结果显示，位于EnhⅠ/Xp和EnhⅡ/Cp启动子的HNF4结合位点是调控C启动子活性及3.5 kb mRNA转录的重要因子，在HBV高度组织特异性复制表达中可能具有重要作用。研究结果显示CHB患者体内HNF4的表达水平增高，且HNF4水平与HBV复制水平呈正相关关系。此外，Honda M等用基因芯片对HBV感染患者肝穿刺活检标本的研究结果表明，HBV感染可导致HNF4、RXR/PPAR、C/EBP等HNF基因转录的增加，并可能与肝损伤的发生相关。因此，HNF与HBV基因转录调控间的相互作用，有可能在乙型重型肝炎发病机制中扮演重要角色。
Deng等通过对Th1型免疫反应通路上的CXCL10基因进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)研究，发现存在于CXCL10基因启动子区的多态性位点G-201A与男性HBV携带者的病程进展显著相关。凝胶电流迁移率(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)实验显示G-201A位点能改变与核蛋白的结合能力；报告基因实验证明该位点能影响CXCL10基因启动子区的转录活性；mRNA实时定量实验表明，在PBMC中易感等位型G-201G的表达量显著高于G-201A等位型；ELISA和免疫组化实验均发现进展期的CHB患者的血浆和肝组织中CXCL10蛋白含量显著高于非进展期患者。上述研究表明，G-201A是一个新发现的功能性多态性位点，CXCL10蛋白参与乙型肝炎患者肝组织的炎症和坏死过程，能影响CHB的病程进展。(https://www.daowen.com)
此外，Yan Z等报道，IFN-γ基因的突变可影响IFN-γ的表达，是HBV感染慢性化的易感因素；预后差的暴发性肝炎患者TNF-α基因启动子区-1031C、-863A及TNF-βB2对偶基因出现的频率更高；IL-10基因启动子区SNP与慢性HBV感染的进行性发展有关；与健康对照组相比，暴发性肝炎患者IL-10基因启动子区下调IL-10表达的单倍型基因出现频率更高，上调IL-10表达的单倍型基因出现频率更低。Yan等也从群体水平揭示了Th2型免疫反应通路上的IL-10基因启动子多态性与慢性乙型重型肝炎的关系，为IL-10启动子自然选择学说及急性肝衰竭的全身炎症反应综合征病理生理学理论提供了新的证据。
Han等在hfgl2基因的调控机制和网络研究时发现，HBc蛋白和HBx蛋白均具有激活hfgl2的功能，而HBs蛋白则不能激活该基因；系列启动子缺失试验表明，在hfgl2基因启动子-712～-568位之间存在着激活该基因的调控序列，在病毒蛋白作用下，转录因子c-Ets-2能与hfgl2基因启动子上相关顺式作用元件结合，从而激活该基因的表达；乙型重型肝炎患者的P-JNK及P-ERK的磷酸化水平较健康对照者明显增强，提示重型肝炎患者JNK及ERK信号转导途径被激活。体外试验结果显示，在病毒蛋白HBx及HBc作用下，信号转导途径JNK及ERK分别被激活，c-Ets-2的表达及转位与JNK及ERK的活性有关。以上结果说明，HBV蛋白HBc及HBx分别通过激活JNK途径及ERK途径，继而激活转录因子c-Ets-2，使其移位至核内，并与hfgl2基因启动子上顺式作用元件结合从而上调hfgl2基因的表达。
TNF-α是肝衰竭的重要炎症因子，mfgl2在鼠暴发性肝炎及ACLF中起重要作用。Gao等构建了mfgl2和TNFR1基因的真核表达载体、绿色荧光融合蛋白及其shRNA干扰质粒。采用mfgl2和TNFR1基因联合干预较单个基因干预能更有效地提高重型肝炎小鼠的生存率，改善其血清学和肝脏病理等改变。由此可以提示hfgl2和TNFR1这两个重型肝炎相关基因在HBV患者病情的发展过程中可能具有协同作用。
HBV感染是重型肝炎发生、发展的必需条件和病因所在，而HBV基因组转录与复制又是HBV生活周期的核心环节。从基因转录调控这一新的角度入手，深入研究HBV基因转录调控在乙型肝炎重症化中的作用和机制，将为寻找预测和监测重型肝炎发生及发展的宿主转录因子标志提供线索，为发展重型肝炎治疗的有效手段提供新的作用靶点。
(三)乙型肝炎重症化的全基因组关联研究
全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)于2005年以后开始兴起，成为目前复杂疾病遗传关联研究的主流。该策略不需要预先选择候选基因，而是直接选取全基因组范围数以十万计的SNP位点和数以十万计的拷贝数变异(copy number variation，CNV)位点进行全基因组关联分析。与候选基因策略相比，全基因组关联策略在统计效能上有着极大的提高，同时可以避免群体分层偏倚和基因选择的偶然性。
近年来，国内外学者应用GWAS技术开展了HBV的持续性感染、ACLF患者对聚乙二醇化干扰素的应答及HBV相关肝癌等方面的研究，取得了一些重要发现。周钢桥教授等对1251例持续性HBV感染患者(PIs)与1057例自发性康复的HBV感染者(SRs)进行了对比研究，在染色体8p21.3鉴别出一个新的基因位点(rs7000921，OR＝0.78，p＝3.2×10-12)，并进一步发现INTS10可以在肝细胞上经IRF3抑制HBV的复制，对临床血浆标本的检测也证实，PIs INTS10的水平明显低于SRs，且与病毒载量呈负相关。以上证实了新的抗病毒基因INTS10在HBV感染清除中的作用。
邓国宏教授等在国际上首次应用GWAS技术，对399例HBV-ACLF患者和401例HBV慢性携带者的单核苷酸多态性(SNP)进行了测定，并在初步研究结果的基础上，对4组共计901例HBV-ACLF患者和1686例HBV携带者进行重复分析和临床表现的关联性研究，结果发现位于人白细胞抗原(HLA)Ⅱ类区(染色体6p21.32)的rs3129859与HBV-ACLF相关(p=2.64×10-20，OR=1.83)，同时证明HLA-DRB1*12：02是与ACLF关联的易感HLA等位基因，(p=3.94×10-6，OR=2.05)，相对于肝硬化基础上的ACLF，rs3129859与无肝硬化的ACLF关联度更高；与低病毒载量和HBeAg阳性的CHB相关ACLF也有明显的关联。此外，rs3129859*C等位基因也与较长的PT、较快出现腹水及较高的28天病死率相关。以上表明，HLA-DR是HBV-ACLF易感基因位点所在的区域，同时说明HLAⅡ类抗原限制性CD4+T淋巴细胞路径在HBV相关ACLF的发病中起到重要作用。
(四)表观遗传学与乙型肝炎重症化
表观遗传为没有DNA序列改变的、可遗传的基因表达改变。目前认识到的表观遗传变异主要包括微小RNA(microRNA，miRNA；small interfering RNA，siRNA)、DNA甲基化(DNA methylation)和染色质重塑(chromatin remodeling)等。
1.微小RNA
miRNA是一类高度保守的在转录后水平调节基因表达的非编码RNA，可以与mRNA的3′端非翻译区相互作用，负性调节基因的表达。miRNA在机体的许多生物学事件如增生、分化、组织重塑、凋亡和免疫反应中发挥作用。大量研究表明，miRNA在部分脏器慢性损伤特别是肝脏的慢性损伤过程中存在差异性表达，可能与脏器慢性损伤的发生、发展存在相关性。由于miRNA可以在组织标本中检测到，因此有可能用于一些疾病的诊断。
高随等构建了hFas和hTNFR1基因的miRNA表达质粒，并对其进行了体外细胞水平的实验，结果证明了hFas和hTNFR1基因的miRNA表达质粒对相应基因有特异性的抑制作用，表明它们对病毒诱导的重型肝炎的治疗具有潜在的临床应用价值。
多项功能研究也表明miRNA参与调节多个炎症通路因子的表达。有研究发现，miR-150和miR-223可能与病毒性肝炎的肝细胞炎症活动有关。miR-150主要参与调控B淋巴细胞的成熟，还通过调节Th1与Th2细胞的分化参与机体炎症反应。miR-223位于人类X染色体，在粒细胞系细胞特异性高表达。Johnnidis等发现在miR-223基因敲除小鼠，粒细胞增加两倍多，并且这些粒细胞对外界抗原刺激(尤其是真菌)更加敏感。但是与未敲除miR-223的小鼠相比，miR-223基因敲除小鼠肺部炎症反应更加明显，且内毒素刺激所引起的组织损害更加严重。
陈莉等研究发现，与乙型肝炎重症化相关的7个易感分子如下：miR-487a(在孪生乙型重型肝炎患者中表达下调)、miR-7a(在孪生乙型重型肝炎患者中表达升高)、miR-16(在乙型重型肝炎患者中表达升高)、miR-122(为乙型肝炎重症化及疾病进展提供预警信号)、miR-1187(随肝衰竭的进展呈现明显下降趋势，可作为预测乙型肝炎病情进展、重症化的标志物)、miR-155(表达随病毒的清除逐渐下降，可作为乙型肝炎重症化转归的生物学标志，为乙型肝炎重症化及治疗提供了新的预警信号)、miR-197(该分子的表达下调对肝脏炎性活动具有预测价值)。此外，有研究表明，miR-210在ConA诱导的鼠肝炎模型的肝脏和血清中明显升高，不仅与肝脏炎症导致的低氧血症密切相关，而且与临床乙型肝炎患者的病情严重程度及ALT、AST、TBil及PTA等肝损伤指标密切相关。由此可见，乙型重型肝炎患者体内存在与肝细胞炎症程度相关的特异性miRNA，可为重型肝炎的早期预测提供新的指标或靶点。
已知部分急性肝衰竭(ALF)患者的肝脏可以良好再生因而可以自发性康复，但是其潜在的分子机制并不清楚。John K等研究了不同的miRNA在肝脏修复中的作用，结果表明，与健康对照相比，ALF患者血清中的miR-122和miR-21水平明显升高，p＜0.01；ALF自发性康复者(SRs)血清miR-122、miR-21和miR-221水平也明显高于非自发性康复者(指死亡或经过肝移植康复的患者，NSRs)，p值均小于0.05。对肝组织的研究也发现，miR-122在ALF-SRs中也明显升高，但miR-21和miR-221水平则明显减低。除了SRs血清miRNA水平的升高，作者还观察到，与NSRs比较，上述3种miRNA的靶基因产物血红素氧合酶-1(HO-1)、程序性细胞死亡分子4(PDCD4)和细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂(CDKI)p21、p27、p57明显降低。进一步依据3种miRNA的血清水平计算的AUC均为0.66，其中miR-122、miR-21和miR-221的敏感性依次为67%、71%和60%，特异性依次为57%、52%和76%。以上结果表明，一些miRNA在预测ALF患者转归方面具有潜在的应用价值。
2.DNA甲基化
戚朝霞等研究发现Th1和Th2细胞在IL-10基因启动子区染色质凝集状态不同，干扰启动子和转录因子的结合，影响IL-10基因转录。肝衰竭患者组甲基化分布状态与CHB患者组和正常对照组相比具有显著性差异，IL-10血清含量与启动子甲基化状态呈负相关。提示IL-10基因启动子区的甲基化可能参与肝衰竭的发病过程，是IL-10水平变化的原因之一。
近年研究表明，氧化应激发生时，肝脏的Kupffer细胞、其他炎性细胞可以产生大量的自由基和活性氧，后者可以引起瀑布效应，导致大量的钙蓄积，血循环障碍和某些细胞因子的表达，成为乙型肝炎患者肝脏炎症和损伤的重要因素。谷胱甘肽(glutathione，GSH)作为体内重要的抗氧化剂，是防护细胞免受氧化应激损伤的重要机制之一。而谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)能够催化GSH与多种超氧化物及毒性产物的结合，因此可以防护肝脏免受这些物质的损伤。已发现HBV感染可以减弱GST的产生，HBx可以抑制GSTP1(GST 启动子1)，在肝细胞癌患者，GSTP1表达的减低与其甲基化密切相关。为此，Li T等观察了HBV-ACLF患者的肝损伤与机体氧化应激和GSTP1甲基化的状况，发现与CHB患者比较，HBV-ACLF患者不仅氧化应激更加明显，而且其GSTP1的甲基化比例也更高。作者认为，HBV-ACLF患者GSTP1的甲基化可能促进了氧化应激相关肝损伤的发生。
已证明G蛋白偶联的胆汁酸受体Gpbar1(TGR5)可以负向调节肝脏的炎症反应、减少肝脏损伤。推测ACHBLF病程中可能存在TGR5的甲基化，导致该基因的表达下调，防护肝脏损伤的功能受到抑制。Gao S等对此进行了研究，他们采用甲基化特异的PCR技术(MSP)，共检测了76例ACHBLF患者、80例CHB患者和30例健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)TGR5启动子的甲基化状况，同时用定量PCR测定了TGR5的mRNA水平。发现ACHBLF患者PBMC启动子的甲基化频率明显高于CHB组患者和健康对照者，3组分别是46.05%、6.25%和3.33%，p＜0.01。相应的TGR5 mRNA的水平在ACHBLF组则明显降低。将TGR5甲基化率用于区分ACHBLF与CHB患者，其敏感度为46.05%，特异性为93.75%；阳性预测值为87.5%，阴性预测值为64.66%。将TGR5甲基化率用于预测ACHBLF 3个月的病死率时，其曲线下面积(AUC)为0.75，明显高于MELD评分的0.65，p＜0.05。作者认为，TGR5启动子区的异常甲基化可以作为ACHBLF的潜在预后指标。
七、其他与乙型肝炎重症化相关的分子标志物
(一)TLRs信号通路的激活
TLRs介导的信号转导途径有MyD88依赖型和非依赖型途径。TLR-7、TLR-8、TLR-9介导的信号通路属于MyD88依赖型信号通路，TLR-3介导的信号通路属于MyD88非依赖型/TRIF依赖型信号通路。MyD88依赖型信号通路中，TLRs识别配体后激活NF-κB和MAPK，诱导多种细胞因子的释放，上调免疫细胞表面的CD80、CD86等共刺激分子，最终激活特异性免疫系统。
TLR-2、TLR-4在乙型肝炎重症化的发病机制中起着重要的作用，能较好地预测疾病的发展趋势，可作为评价乙型重型肝炎预后的指标。
TLR-4是内毒素跨膜信号转导的关键受体，是单核-巨噬细胞系统进行LPS跨膜信号转导中的限速因子。研究发现，重型肝炎患者TLR-4 mRNA的表达水平明显高于正常人，在死亡组恶化期明显高于极期，存活组治疗好转后明显低于极期。此外，TLR-4 mRNA的表达变化与内毒素水平呈正相关。邓敏等研究指出，重型肝炎患者易发生内毒素血症，内毒素与TLR-4结合后跨膜信号通过TLRs的胞内结构激活NF-κB，然后进一步引起TNF-α、IL-1等炎症因子的释放，产生继发性肝内微循环障碍。
TLR-2是一种具有广泛识别能力的模式识别受体，能够识别革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、螺旋体、结核分枝杆菌及支原体等多种细菌的细胞壁成分，在多种微生物所致急、慢性感染中均具有重要作用。晏春根等对D-Gal/LPS诱导的暴发性肝衰竭小鼠TLR-2表达进行研究后发现，肝衰竭小鼠TLR-2 mRNA表达水平持续升高，TNF-α等相关因子水平也升高，提示TLR-2可通过启动下游的炎性应答基因表达及细胞因子释放而参与D-Gal/LPS诱导急性肝衰竭。
(二)乙型肝炎重症化过程中代谢组学的变化
代谢组学是通过定性、定量观测生物体受到体内外各种刺激或内、外环境变化时各种内源性代谢产物的种类和数量随时间的变化，来研究生物体的生物学状况并发现和确定相关的生物标志物的一种技术。研究对象是代谢网络中相对分子质量小于1000的小分子化合物。目前代谢组学研究的技术手段主要包括核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance，NMR)、气相色谱(gas chromatography，GC)、液相色谱(liquid chromatograph，LC)、毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)、质谱(mass spectrum，MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、红外光谱、紫外光谱等。用途较广泛的是NMR、GC-MS和LC-MS。
Yang等联合高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术和偏最小二乘法(partial least square，PLS)分析技术对感染HBV后肝功能急剧恶化的患者进行血清学分析，结果发现溶血磷脂酰胆碱和鹅脱氧胆碱甘氨酸中个别原子发生了改变，可用于疾病恶化的早期预测。Feng B等运用GC-MS联合PCA软件对暴发性肝衰竭大鼠血清进行代谢产物分析，结果显示血清中5-羟吲哚乙酸、葡萄糖、β-羟丁酸盐和磷酸盐含量增高，提示血清中这些物质的改变有可能成为暴发性肝衰竭的潜在生物标志物。Yu等创建了基于GC-MS和HPLC的肝衰竭代谢组学研究平台，建立了肝衰竭患者疾病严重程度的评估模型，发现代谢组学数据通过正交偏最小二乘法分析后，可建立患者血清特异性代谢谱，应用该代谢谱判断患者预后，其准确率可达91.3%。Mao等用此方法也得到了高达93.62％的肝衰竭诊断正确率，并且发现血浆柠檬酸盐的峰值改变具有重要的诊断学意义。
李兰娟院士指出，应用代谢组学对肝衰竭患者人工肝治疗前后不同预后进行分析发现，溶血卵磷脂水平降低、脂肪酰胺水平升高、胆汁酸含量不升高是预后不良的危险因素。通过对人工肝治疗前后患者血清代谢组谱的变化趋势分析，可判断患者预后情况，并可较好地判定人工肝治疗的效果。
(三)内质网应激与乙型肝炎重症化
内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞中蛋白质翻译合成和细胞内钙离子储存的场所，在蛋白质的折叠中也起到重要作用。多种生理或病理条件如蛋白质糖基化的抑制、钙离子的流失等引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网聚集及Ca2+平衡紊乱状态，称为内质网应激(ER stress，ERS)。由于肝脏在蛋白质合成中具有关键作用，因此其对经ERS途径导致的损伤非常敏感。肝细胞处理ERS的保护性应答机制称未折叠蛋白应答(unfolded protein response，UPR)，这一应答过程活化后可以启动一系列不同的转录因子，激活内质网膜上的三种跨膜蛋白PERK、ATF6和IRE-1α，使内质网伴侣蛋白基因转录上调、蛋白质翻译减少；未折叠蛋白移入胞质并被降解，从而维持细胞的正常功能。当UPR不能有效地处理应激，肝细胞受损过于严重时，则会触发细胞的凋亡机制，导致病毒复制、肝脏损伤和肝衰竭。
段钟平等对19例HBV感染相关的ACFL的研究表明，与健康对照组和CHB组比较，ACFL组患者UPR的三种途径——PERK、ATF6和IRE-1α在转录和翻译水平均明显减弱，而各种凋亡分子和凋亡的肝细胞却明显增加，表明内质网应激在乙型肝炎重症化的进程中起到重要作用。
(四)干扰素诱导蛋白N-myc相互作用因子NMI与乙型肝炎重症化
转录因子(transcription factor)是调控众多基因复制和表达的关键。体内有一类蛋白可以间接影响特定的转录事件，其中N-myc和STAT相互作用因子NMI便是新发现的重要成员。编码NMI的基因位于染色体2q23，分子质量为38kD，在人体的大多数重要器官表达，多存在于细胞的胞质中。NMI是近年发现的第一种能与致癌基因N-myc和C-myc结合的蛋白，其功能多与被结合的蛋白分子有关，不仅可以上调或下调肿瘤的生长，而且与免疫调节、促炎反应及病毒感染的发病过程密切相关。Xiong L F等调查了50例HBV-ACLF患者外周血血清、单个核细胞及部分肝组织中NMI的表达和转录情况，发现与CHB组和健康对照组相比，NMI在基因和蛋白水平均显著升高(p＜0.001)；亚组比较表明，24例危重的ACFL患者(死亡18例，接受肝移植治疗6例)血清基线NMI水平是26例存活ACLF患者的2.4倍，且NMI在病程中始终维持在较高的水平，而存活患者出院前NMI水平均有明显下降。
以上研究表明，血清NMI不仅可用于判定HBV相关肝病的轻重，而且可以作为判定HBV-ACLF预后的生物学指标。
(五)甲状腺功能和促甲状腺激素与乙型肝炎重症化
已知各种病因的慢性肝病和肝硬化均伴有甲状腺功能障碍和促甲状腺激素(TSH)分泌的异常。Wu Y C等测定了75例HBV-ACLF患者的甲状腺功能，并与70例CHB患者进行对比，发现ACLF组患者T3、T4、FT3、FT4和TSH均显著减低，且与MELD评分成反比。此外，死亡ACLF患者的T3、T4和TSH水平也显著低于存活患者，其中血清TSH水平可以用于预测HBV-ACLF患者的病死率，当其小于0.38 IU/mL时，累计的生存率将显著降低。以上表明，测定血清TSH可用于评估HBV-ACLF患者的病情和判定预后。
八、血浆电解质及酸碱检查
(一)血浆电解质
肝衰竭患者因常伴有肾血流量下降及滤过率降低，故易出现电解质紊乱。多数患者表现为低钾血症、低钠血症、低镁血症和低钙血症。低钠血症的发生和严重程度与肝衰竭预后呈显著正相关，一组有关ACLF患者的分析表明，合并低钠血症的ACLF患者90天无肝移植的生存率仅有35.8%，而未合并低钠血症的ACLF患者的生存率为58.7%，两组比较p＜0.001。分析还显示，合并低钠血症的ACLF患者，其MELD评分、Child-Pugh评分和慢性肝衰竭相关的SOFA评分均明显高于未合并低钠血症的ACLF患者。另一组260例ACLF患者低钠血症的分析表明，109例治愈好转的患者持续性低钠血症的发生率为22.9%，而151例治疗无效死亡的患者持续性低钠血症的发生率为64.9%，两组比较p＜0.01。严重低钠可引起急性低钠综合征及低钠性脑病，低钠血症可损伤肾功能，严重的常促使或加重肝性脑病与肝肾综合征的发生，增加死亡率。有研究显示重度低钠血症(低于115mmol/L)患者的病死率达93.88%。
急性肝衰竭时，氯的摄入不足、呕吐、醛固酮分泌增多、酸中毒等易导致低氯血症，而水摄入不足、肾衰竭、肾小管性酸中毒及过量使用氯化钾又可引起高氯血症。此外，多数患者低磷血症较低钙血症更明显。
(二)酸碱平衡检查(血气分析)
急性肝衰竭患者常出现酸碱失衡(acid-base disorders，ABD)，以碱血症最为常见。李雪梅等分析后认为，动脉血二氧化碳分压降低及呼吸性碱中毒是酸碱失衡最常见的表现。ABD与发生重型肝炎的基础病变无关，血pH是影响重型肝炎患者死亡的重要因素。近年来，一些学者认为ABD预估代偿公式(pre-estimation of compensatory formula，PCF)对判断部分单纯和二重性ABD有实用价值。部分急性肝衰竭患者并发ABD时需借助阴离子间隙(anion gap，AG)、潜在HCO-3和Cl-才能正确诊断。在临床上AG升高是ABD中潜在代谢性酸中毒的可靠指标，AG升高常见于肝性脑病、低氧血症所致乳酸酸中毒、肝肾综合征等，此时肾脏排酸减少，可有酮症酸中毒。潜在HCO-3是排除了高AG代谢性酸中毒对HCO-3掩盖作用之后的HCO-3值，可提高AG代谢性酸中毒和三重ABD中代谢性碱中毒的存在。AG联合血Cl-可分辨出混合性代谢性酸中毒。
各种原发性ABD可相互叠加，演变成二重、三重ABD，例如呼吸性碱中毒历时过久，肾排钾增加，加之医源性因素而合并代谢性碱中毒，病情进展出现多种并发症而再合并代谢性酸中毒即为三重ABD，常为急性肝衰竭患者晚期表现，预后极差。因此，预防和积极治疗ABD是抢救急性肝衰竭的一个重要方面。
九、各种微创检查
(一)肝脏穿刺活体组织检查术
肝脏穿刺活体组织检查术，简称肝穿刺活检术，是临床上获得各种肝病(包括肝衰竭)时肝脏组织病理学改变的一种良好手段，对直观地判断肝脏病变的严重程度具有重要价值。
肝穿刺活检术一般分为经皮肝活检(percutaneous biopsy)、经血管内肝活检(transvenous biopsy)、手术中或经腹腔镜肝穿术(surgical/laparoscopic biopsy)及密闭肝穿术(plugged biopsy)。其中经皮肝活检安全、简便，无需特殊器械或设备，目前在临床上应用最为普遍。而经血管内肝活检主要适用于有中、大量腹水，凝血功能缺陷，由于肝硬化导致肝体积明显缩小且肝脏硬度明显增加，由于明显肥胖以致难以分辨确定季肋部的患者以及肝静脉压力较高的患者。
以下情况宜列为经皮肝活检的禁忌证：①PT过度延长、PTA过度降低，估计即使轻微损伤所致的出血也难以自行止血者；②皮肤出现大片淤点、淤斑或有明显体腔出血表现者；③意识不清，估计在术中不能进行良好配合者；④有中等量以上腹水，尤其是合并腹腔感染者；⑤有明显胸水和严重心肺疾病患者。
实践证明，虽然肝衰竭患者凝血机制有明显障碍，但只要进行周密准备、细心操作，肝穿刺活检术还是相当安全的。需要指出的是，虽然肝穿刺活检术对了解肝组织变性、坏死和炎性细胞浸润程度等具有十分重要的价值，但由于所得到的肝组织有限，因此活检组织的病理学改变有时并不能全面准确地反映整个肝脏的病理变化。临床医师需将肝活检报告与各种临床资料及实验室检查结果联系起来进行分析，力求准确判断患者的病情。
(二)颅内压测定技术
重型肝炎时脑水肿的发病率较高，可达50%～80%，其中25%左右可发生脑疝，引起患者死亡。因此，监测颅内压对脑水肿的诊治具有重要意义。
传统的腰椎穿刺测压法只能测定一次颅内压的结果，不能动态、准确地观察颅内压的变化，且对颅内高压患者腰椎穿刺可能导致或加重脑疝。另外，在已有脑疝的情况下，颅腔与脊髓腔已不相通，腰椎穿刺所测压力不能代表颅内实际的压力。因此持续的颅内压监测弥补了腰椎穿刺法的不足，而脑室导管法仍为当前临床广泛使用的方法，被临床医师认为是当前颅内压监测的“金标准”。
颅内压持续超过15mmHg时称为颅内压增高，根据颅内压的不同，将其分为以下4级。①正常：5～14mmHg。②轻度升高：15～20mmHg。③中度升高：21～40mmHg。④重度升高：大于40mmHg。如果颅内压接近平均动脉压，实际上已无血液向脑内灌注，患者濒临脑死亡。目前国际上多采用20mmHg作为进行降颅内压治疗的临界值。
颅内压测定的并发症主要包括感染、颅内出血、医源性颅内高压和脑实质损伤等。
十、小结
虽然实验室检查指标可以及时、敏感地反映乙型肝炎重症化和重型肝炎病程中肝脏的病理变化和功能状况，为临床分型评分和疗效的评估提供客观、翔实的参考数据，但是总的说来，本节介绍的大部分指标，尚处于研究和试验阶段，其有效性和实用性尚待更多临床实践的检验；而目前已在临床上广泛开展和应用的实验室检查指标仍然有限，其中得到公认并在大多数医院普遍开展的实验室检查指标主要有PTA、INR、血清胆红素、ALT/AST、前白蛋白、血氨等。此外，一些研究认为血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、血清钠、磷酸盐等与肝衰竭预后也密切相关。
有些指标如动脉血乳酸、PCT、NAGL、iNOS等虽然与重型肝炎/肝衰竭有较好的相关性，但在其他病因引起的危重症特别是感染性休克、多器官功能障碍综合征中也呈现明显异常，因此并非乙型重型肝炎和肝衰竭所特有。大多数与免疫或炎性细胞/因子相关的指标也是如此，有较高的敏感性，但缺乏特异性。还有些与遗传相关的指标和反映组学(如代谢组学、基因组学、蛋白组学、糖类组学等)变化的检测或者仍处于研究阶段，或者需要昂贵的仪器设备，因此短期内还难于在临床常规开展。
需要指出的是，除了上述单一指标的检测分析外，国内和国外近年建立测试的各种预后评分系统和数学模型，如KCC、MELD评分及Child-Pugh评分等，对于精确地判断重型肝炎(肝衰竭)预后具有更高的准确性和实用性，不过，它们仍有待补充和完善。
应当看到，由于乙型肝炎重症化和乙型肝炎相关的肝衰竭在诱因、临床类型、病程、并发症、临床干预措施等方面存在多样性及个体化差异，目前一些反映肝衰竭预后的指标仍存在不少问题。相信随着乙型肝炎重症化机制和临床特点研究的深入，越来越多的新指标将会应运而生，重型肝炎(肝衰竭)的救治效果也将因此得到改善和提高。
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