乙型重型肝炎(肝衰竭)的细胞移植治疗
陈红松 张恒辉 刘峰
一、概述
目前，肝移植作为各种终末期肝病的有效治疗手段，已被应用于治疗急、慢性肝衰竭和基因缺陷所致的代谢性肝病。但是肝移植应用也面临着诸多难以克服的问题，例如，肝脏供体数量严重不足，移植术后长期应用免疫抑制剂导致的对机体免疫系统的抑制，进而增加疾病易感性和原有疾病的复发(如病毒性肝炎)，移植本身及移植后带来的高额医疗费用。为克服肝移植上述缺陷，研究者们也在积极地探讨利用成熟的肝细胞、肝相关干细胞及免疫细胞等来治疗终末期肝病、恢复肝功能。自20世纪70年代以来，随着基础研究的突破，国内外陆续开展了关于利用肝细胞、骨髓及胚胎来源的干细胞移植治疗重型肝炎的临床前研究及临床研究，同时针对慢性病毒性肝炎、肝脏肿瘤等疾病开展了基于免疫学的抗肝炎病毒、抗肿瘤的免疫细胞移植治疗。这些治疗手段极大地丰富了临床医师对终末期肝病的治疗方案，同时也有部分细胞移植治疗已经应用到肝病的临床治疗中。本节将结合近年的研究进展对肝细胞移植、干细胞移植及其他类型的细胞移植治疗乙型重型肝炎(肝衰竭)的现况和前景进行阐述。
二、肝细胞移植治疗乙型重型肝炎(肝衰竭)
(一)概述
乙型重型肝炎是一种病死率极高的临床综合征，在我国主要由HBV慢性感染引起。目前针对这一疾病尚无特别有效的治疗方法，仍以综合支持治疗为主。近年开展的较为有效的治疗方法主要有肝移植、人工肝支持系统。而目前肝移植治疗中供肝匮乏一直是影响肝移植深入发展的瓶颈，采用人工肝支持的血液净化技术也只能代替肝脏的部分解毒功能，长期疗效无法令人满意。细胞治疗是指将分离获得的原代正常细胞、干细胞或由其分化产生的功能细胞，或将细胞经体外遗传操作后用于疾病治疗的方法。近年，肝细胞移植技术获得了较大的进展。将肝细胞移植作为治疗终末期肝病的一种有效方法在多种动物模型、临床前研究以及临床研究中得到了证实，与肝移植和人工肝支持治疗相比，肝细胞移植具有下列优点：①创伤小，治疗相对安全，手术并发症少；②分离获得的肝细胞可进行冻存并可移植给多位患者，缓解供体来源短缺问题；③肝细胞的低免疫原性可有效减少移植后的排斥反应；④肝细胞移植后可快速发挥替代作用，参与肝脏的再生。
鉴于肝脏的细胞构成包括实质性肝细胞、胆管细胞、内皮细胞、星状细胞、Kupffer细胞及干细胞等，所以肝细胞的移植需要先将供体的肝脏在原位进行插管灌注、分离、纯化、培养、鉴定之后将具有正常细胞功能的活性肝细胞注入受体内，从而部分替代肝脏的合成、分泌、代谢等功能。因此，在进行肝细胞移植治疗的研究及临床应用中，肝细胞的分离、保存、扩增、回输途径及回输部位均影响肝细胞移植治疗的效果。
(二)肝细胞移植中的细胞来源
肝细胞移植的理想细胞材料应具备以下特点：①具有成熟肝细胞的所有生物学功能；②移植之后能够在移植部位发挥较高的活性及代谢功能；③具有较低的免疫原性、导致感染及致瘤致畸风险；④来源广泛、易于培养并能迅速生长至高密度，不发生变异，可在体外长期保存。基于上述特点，目前用于肝细胞移植研究的主要有3种细胞，即肝细胞、永生化肝细胞和肝相关干细胞。
就肝细胞移植理想细胞的来源而言，成熟的人肝细胞最接近临床应用的要求，但其来源同样受到供肝短缺的限制。并且由于近年来脂肪肝发病率的增高、肝炎病毒感染等因素，具有严重脂肪变性及肝炎病毒感染的供者肝脏也难以作为肝细胞移植的来源。与人源肝细胞相比，异种肝细胞具有来源广泛的显著优点。最常用的异种肝细胞源是猪肝，虽然它能提供与人肝结构相似、功能相近的肝细胞，但异种肝细胞移植存在严重的免疫排斥和交叉感染的问题。永生化肝细胞是一种具有良好特征性的可移植肝细胞，它解决了增殖难题，具有成为取之不竭的细胞源的潜力。但由于其具备癌基因的表达，其致瘤风险、安全性问题未解决，这在一定程度上限制了其临床应用。此外，肝相关干细胞具有分化为成熟肝细胞的能力且增殖分化能力强，免疫原性低，有望成为肝细胞移植的理想细胞来源。
(三)肝细胞的分离、保存和扩增技术
肝细胞移植首先要获取游离的、活性较好的大量肝细胞。目前采用的分离肝细胞的方法主要包括机械分离法、EDTA螯合法、TPB螯合法和酶解法。机械分离法最早在20世纪50年代开始应用，但该方法在分离过程中的机械剪切力可导致获得的肝细胞活性不高，目前采用此方法分离已经较少。1967年Howard等学者建立肝脏胶原酶灌流法，Berry和Friend等在该方法的基础上采用无钙平衡盐、胶原酶和透明质酸酶等对消化液进行了改良，使分离肝细胞在数量和活性上获得了较大的改善。Seglen等将上述方法进一步发展为两步灌流法，第一步灌流通过预先灌注预热的无钙平衡盐溶液以去除肝窦内的血细胞及部分非实质细胞，第二步灌流含有胶原酶的平衡盐溶液，进行体外消化后再进行肝细胞的分离提纯。通过两步灌流法可有效地分离肝细胞并保证细胞的活性，目前该方法也作为实验室分离肝细胞的常规方法。在两步灌流法的基础上，研究者们又进行了一系列的改良，建立了其他多步分离步骤。虽然目前围绕肝细胞分离的研究已经进行了近70年，但是如何优化肝细胞分离方法仍是进行肝细胞移植治疗研究的重要内容之一。
肝细胞分离方法的研究既昂贵又耗时。越来越多的临床中心利用原发的良性或恶性肿瘤来分离获得肝细胞。即便如此，基于临床应用或研究目的的临床中心只是少数，但肝细胞低温冻存技术和体外培养技术的发展促进了肝细胞库的建立。有学者证实，低温冻存的肝细胞在冻融后仍然具有与新鲜肝细胞同等的代谢能力和克隆复制能力，并且冻存肝细胞在临床试验中也已取得良好的治疗效果。Pless等研究表明肝细胞在改良后的器官保存液中冷藏2周后乳酸脱氢酶的释放低于20%，Pless极大地改善了人类肝细胞的冷藏技术。但肝细胞的体外大量培养费用昂贵，且不能有效维持原代肝细胞的功能和生存率。近期，邓宏魁研究组等以体外培养过程中快速失去功能的人原代肝细胞为研究对象，筛选到5种化学小分子的组合并利用它们在体外成功实现了肝细胞白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢等肝细胞功能的长期维持。目前，采用球形聚集、微载体黏附等形式的肝细胞悬浮液培养方法，不仅能延长肝细胞存活时间，而且能保持正常的肝细胞形态、功能和良好的分化增殖潜能，尤其适用于肝细胞移植的临床应用。
(四)肝细胞移植中的细胞回输部位及途径
肝细胞移植中的细胞回输部位：①经门静脉系统、肝动脉或经肝脏穿刺注入肝内；②脾脏；③腹腔内(胰腺、肠系膜间等部位)。早期研究认为门静脉或肝实质应为供者肝细胞的理想植入场所，但是由慢性肝炎引起的肝衰竭而需要进行肝细胞移植的受体多存在肝硬化，在细胞移植过程中细胞外基质影响移植肝细胞定植，同时门静脉内肝细胞移植也会导致严重的肝损伤和广泛性的肝细胞坏死。对于肝硬化患者，脾脏是相对适合的肝细胞移植部位，肝硬化患者增大的脾脏可更多地容纳移植的肝细胞，移植的肝细胞可以长期存活、增殖，并保持肝细胞的形态和功能，形成肝化脾。而经门静脉途径的肝细胞移植适用于代谢性肝病患者。腹腔内肝细胞移植，技术简单，并可反复进行，在进行肝细胞移植初期常首先被选用。但由于腹腔环境无法为肝细胞提供长期附着及生存支持，植入的肝细胞寿命短暂，并且植入的肝细胞易使受体致敏，致使移植的肝细胞在短期内即被清除。近年来，生物膜的出现有助于肝细胞的腹腔移植，通过胶原包裹或藻酸盐微囊化肝细胞均可延长肝细胞在腹腔内的生存时间。Yokoyama等利用聚乙烯醇的网孔状装置辅以多聚化合物制成表面涂层植入皮下，进行成纤维生长因子等血管生成因子的缓释，并辅以肝细胞的移植，可在皮下显著延长肝细胞的存活时间。
(五)肝细胞移植治疗乙型重型肝炎的研究及临床应用现状
肝细胞移植的主要目的是使移植进入体内的肝细胞在宿主体内长期存活、增殖，促进肝细胞的再生，同时也可给肝衰竭患者提供一个暂时的代谢支持，为患者在等待肝移植前争取更长的生存时间，甚至为自身肝脏的修复与再生提供机会。基于动物模型及临床前研究的进展，众多研究中心也开展了肝细胞移植治疗的临床研究。
国外利用肝细胞移植治疗慢性肝炎及肝硬化的最初临床应用是1993年Mito等研究者通过外科手术切下的自体肝组织分离的肝细胞进行肝细胞移植，治疗10例男性肝衰竭患者，应用同位素扫描证实9例中有8例在脾脏内发现肝细胞，成为肝化脾，但存活10个月以上者仅有1例。后续的研究中肝细胞移植的应用主要是作为急、慢性肝衰竭患者在等待肝移植前的改善治疗，通过分离供肝中的肝细胞并经脾动脉或门静脉输注，明确移植肝细胞在肝脏或脾脏的定植，这些研究初步提示了肝细胞移植对肝衰竭患者血清转氨酶以及凝血酶原时间等指标有一定程度的改善。Habibullah及Bilir等应用肝细胞移植治疗5例暴发性肝衰竭患者，其中有3例生存期比预期延长了10天以上。有14例暴发性肝衰竭患者需要行肝移植术而在等待供肝期间接受了肝细胞移植治疗，其中6例在1～10天等到供肝；2例在等待供肝期间因接受了肝细胞移植完全恢复而没有行肝移植术。Fisher等也报道了肝细胞移植治疗暴发性肝衰竭完全恢复的病例。在国内肝细胞移植治疗的临床应用中，陈成伟等在1985年从早孕意外流产者获得人胎肝细胞作为同种异基因移植肝细胞，通过静脉输注治疗肝衰竭取得了较好的疗效。在接受肝细胞移植治疗的患者组中，凝血酶原时间、总胆红素(TBil)等指标均有改善，肝性脑病和组织学改善尤为突出。杨永平等在2004年应用肝细胞移植治疗7例重型肝炎，2例痊愈，2例好转，1例死亡，1例无效，1例之后行肝移植术。
上述研究及近年正在开展的临床研究涵盖多种类型的肝病，对乙型重型肝炎患者的肝细胞移植也包括在这些研究中，这些患者经肝细胞移植治疗后肝功能在一定程度上得到了改善，与其他类型肝病的肝细胞移植治疗相比，未见到显著的差异。Fisher和Fox等研究者分别总结了近年的肝细胞移植治疗遗传性因素、代谢性因素、病毒性因素等导致的肝病的临床研究结果。通过这些初步总结可以看到，肝细胞移植在终末期肝病的治疗中可以发挥重要作用。对于肝衰竭患者的肝细胞移植治疗可在一定程度上恢复患者的肝功能，对于等待肝移植的患者起到延长生存期的作用。但是上述研究主要是针对少数病例的临床研究，肝细胞移植是否有助于患者肝功能的改善及生存期的延长，仍缺乏大规模的规范的病例对照研究确证。
(六)肝细胞移植治疗存在的问题及展望
肝细胞移植作为一种针对急、慢性肝病的治疗方案，随着高分子材料的运用、外科技术水平的提高及免疫药物的进步得到了突飞猛进的发展，在临床上得到了广泛的运用并取得了满意疗效。故肝细胞移植这种新兴的治疗方法，在急性肝衰竭及遗传性肝病方面疗效是值得肯定的。虽然肝细胞移植提高了许多患者的生活质量，但在长期的临床运用中也出现了不少严重的并发症和不足，如免疫排斥反应、细胞移植的短时效应、移植肝细胞原发性无功能、移植肝细胞血管及胆管的生成等问题，有时还会出现肠穿孔、门静脉高压症等严重并发症，加上患者需要长期口服免疫抑制剂，从而可能引发淋巴细胞增生症、恶性肿瘤等疾病。因此，如何促使植入的肝细胞增殖，让其长期发挥作用；如何克服异体移植的免疫排斥反应，保证其有效性和安全性；如何做好移植肝细胞的监测等，仍将是肝细胞移植需要解决的问题。
三、乙型肝炎重症化的干细胞移植
(一)概述
目前临床上对乙型肝炎重症化缺乏有效、特异的治疗手段，主要是进行血浆置换和肝移植术，但由于移植供体匮乏，很多患者在等待移植供体期间死亡。因此及时有效的肝功能支持和促进肝细胞再生，可能可以帮助肝衰竭患者无须行肝移植术而自行恢复或者渡过等待移植的难关。近年来随着干细胞生物学的飞速发展，干细胞移植的出现为乙型肝炎重症化的治疗提供了新的思路。
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。目前可用于干细胞移植的主要是能参与肝脏再生的细胞。从动物实验到临床研究都表明干细胞在体内和体外有向肝系细胞分化的能力，并且可以改善肝功能，促进肝再生。肝相关干细胞按来源大致分为肝源性干细胞和非肝源性干细胞。肝源性干细胞即肝内干细胞，但因其取材困难，分离培养复杂而难以广泛应用。非肝源性干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、骨髓干细胞、脐血干细胞、脐带血干细胞、脂肪干细胞、羊膜源干细胞、牙源性干细胞等，以及通过基因转染诱导获得的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS细胞)。近年来，体细胞重编程为功能肝细胞也是一个研究热点。其中ESCs由于流产胚胎的来源涉及伦理等问题，其广泛应用受到限制。而不同来源的间充质干细胞因来源广、免疫原性低、增殖能力强，在体内外均有极强的向肝系细胞分化的能力，优于以上其他来源肝干细胞的种子细胞，最有希望用于干细胞移植来治疗乙型肝炎重症化。
(二)肝相关干细胞
1.骨髓干细胞
骨髓干细胞不仅具有高度增殖、多向分化的特性和体外操作的可行性，更重要的是它来源于同种或自体，可避免排斥反应。
骨髓干细胞包括造血干细胞(hemopoietic stem cells，HSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。HSCs是研究和临床应用最早的成体干细胞，是所有血细胞的原始起源细胞，有多种特异的表面标志如CD34、CD38、c-kit等，研究者常利用这些标志通过免疫磁珠流式细胞术来分离纯化细胞。EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，又称为成血管细胞，是一群具有游走特征的、能够自我更新和增殖分化的定向干细胞。在缺血性疾病过程中，移植内源性或外源性EPCs可能对成熟个体新生血管的形成有所帮助，并进一步改善器官的功能。
从动物实验到临床研究都表明骨髓造血干细胞可分化为肝细胞，参与肝再生。1999年，Petersen等首先报道肝脏内存在来源于骨髓的肝细胞。Theise和Alison均利用性别交叉移植实验和Y染色体原位杂交技术发现了小鼠和人类的骨髓细胞向肝细胞转化的现象。而对于这些细胞的功能问题，Lagasse等首次做了报道，将纯化的正常成年小鼠HSCs移植治疗FAH缺陷小鼠Ⅰ型酪氨酸蛋白血症，观察到仅需50个HSCs就能在外周血、脾、骨髓和肝脏内不断增殖并纠正肝酶代谢异常。Sun等将骨髓干细胞输入肝纤维化小鼠体内，发现其可能通过旁分泌作用来改善肝纤维化。
考虑到重型肝炎发生时，不仅涉及肝实质细胞坏死的问题，也涉及肝内缺血的问题，骨髓EPCs在肝损伤发生时，参与肝血管重建，进而促进肝脏的损伤修复是可能的。笔者和日本学者的研究发现在肝损伤动物模型中，移植的骨髓EPCs在肝内可分化为内皮细胞，主要沿汇管区和纤维间隔血管壁分布，并且改善了肝功能，使肝损伤减轻，肝细胞增生明显，受体生存率提高，表明EPCs可以减轻肝损伤，提示对于重型肝炎的治疗策略，不仅可以从直接向实质细胞-肝细胞分化的干细胞考虑，也可以从改善微环境的非实质细胞考虑。
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等在肝脏的发育和再生过程中起重要的作用，单独和联合应用会在体外诱导骨髓干细胞增殖并向肝系细胞分化。Oh等最先将HGF应用于体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞的转化，并在诱导后的细胞中检测到了甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、白蛋白、细胞角蛋白8(cytokeratin 8，CK8)和细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)、c-met等肝系细胞的标志，说明HGF可作为体外诱导骨髓间充质干细胞向肝系细胞转化的诱导因子。目前对于骨髓干细胞的研究仅证实了它的存在、多向分化潜能和强大的增殖能力，但对于分化调控的机制以及分离方法和培养技术的标准化等问题都有待进一步研究。
Gasbarrini等报道了1例有长期酗酒史的药物性肝炎所致急性肝衰竭的男性患者，行B超引导下门静脉注射CD34+外周血干细胞治疗，术后20天肝组织活检发现有大面积的肝细胞再生，其肝功能改善持续超过30天。姚鹏等采取患者自体骨髓分离纯化的骨髓干细胞，通过肝动脉途径移植入肝脏中治疗60例慢性重型肝炎患者。在移植12周后，血清谷丙转氨酶和总胆红素水平下降，白蛋白水平和凝血酶原活动度上升，血氨水平下降。他们还发现，移植后12周患者食欲改善45例，体力好转32例，腹胀减轻28例，60例移植患者中未发现严重并发症。这些临床资料初步表明骨髓干细胞治疗的确能够改善部分患者的肝功能，但存在纳入病例数少、缺乏对照、使用的细胞类型不同、疗效评价指标也不尽相同等局限性，确认这种疗效需要更为严谨的设计和大量的实验数据。
2.间充质干细胞(MSCs)
MSCs 是一类来源于中胚层的具有自我复制和多向分化潜能的干细胞。最初主要从骨髓中提取收集，也可从脐带、脐带血、脂肪、羊膜和牙髓等多种组织中获得。其因来源广泛，且较胚胎干细胞伦理争议少，而成为研究热点。其中以骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)和脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)及脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)研究较多，它们是目前重型肝炎细胞移植研究中研究得较多的种子细胞。
研究表明，通过不同途径将 MSCs 移植到动物体内，MSCs不仅可以通过分化为具有肝功能的肝样细胞或与肝细胞融合，而且同时通过旁分泌效应，分泌与细胞增殖有关的细胞因子和生长因子并发挥免疫调节作用促进肝修复来改善肝功能。国内李君教授团队研究发现人BM-MSCs肝内移植可以成功救治暴发性肝衰竭猪，猪的肝脏内可见大量人源肝细胞并保持长期嵌合。有研究表明将MSCs和肝细胞共培养可以明显提高肝细胞的生存率和功能，这些均提示MSCs可以作为重型肝炎很好的种子细胞。
临床试验中BM-MSCs、UC-MSCs均有报道。国内来自王福生团队等输注的UC-MSCs，以及高志良团队输注的自体或异体BM-MSCs的临床研究均表明MSCs治疗肝衰竭是安全的，可明显改善患者临床症状、肝功能水平和终末期肝病模型评分，提高患者近期生存率且无并发症的发生。目前大多数关于MSCs治疗肝衰竭的研究处于临床前研究阶段，因此需要更大规模的多中心随机研究及更长随访时间以观察其确切疗效。除此之外，相关学者对于MSCs的效果并未持统一意见。也有临床研究表明移植MSCs后患者症状无缓解。影响MSCs治疗的因素较多，其中最主要的因素是MSCs归巢效率。
另外羊膜、脂肪组织及牙髓源MSCs均在动物实验中改善肝损伤状态，但是尚无临床应用。
3.脐血干细胞
新生儿脐血富含干细胞，与其他来源的干细胞相比，脐血干细胞有其自身的优点：①采集过程简单、容易，来源丰富，对孕妇和婴儿无任何痛苦和风险；②易于储存，选择相合供体时间短，可用于自身或异体；③脐血干细胞免疫系统功能不健全，抗原性弱，免疫排斥发病率低，程度轻；④移植费用低，移植成功率高。目前国内外关于脐血干细胞在肝病领域的研究多集中于体外诱导脐血干细胞向肝细胞分化的动物实验研究，临床应用较少。
研究表明，通过添加几种生长因子，脐血干细胞可以被诱导分化成为有功能的肝样细胞，并且表达与肝细胞相关的标志分子。目前常用于诱导分化的生长因子包括FGF、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、HGF等，其中以HGF最为重要。王韫芳等证实在含有肝星状细胞和HGF的饲养层培养条件下可以诱导脐血来源的β2m-c-met+细胞表达肝细胞谱系标志(如白蛋白、AFP、CK18、CK19等)。Kakinuma等利用HGF等培养21天成功地将人类脐血干细胞诱导为表达白蛋白的细胞即肝细胞，并将脐血单个核细胞移植入肝损伤小鼠体内，在4～55周均检测到了肝细胞相关基因的表达。
国内唐晓鹏等最早应用脐血干细胞移植治疗重型肝炎患者，发现脐血干细胞在降低重型肝炎患者血TBil及ALT水平，升高血小板、白蛋白水平及提高胆碱酯酶活性，缩短凝血酶原时间，降低重型肝炎患者病死率等方面均明显优于成人新鲜血浆。但脐血干细胞移植同样存在一些问题：首先，单份脐血所含造血干细胞数量少，且脐血中淋巴细胞不成熟导致移植后造血重建延迟及移植失败，移植相关死亡率高；其次是存在传播遗传性疾病的可能。
4.ESCs
ESCs是具有分化成外、中、内胚层任何细胞能力的全能干细胞，其分化潜能是干细胞家族中最高的，对组织的再生尤有价值。ESCs分化为肝细胞的方法主要有自发分化、体外诱导分化和体内诱导分化。体外诱导ESCs分化为肝细胞是研究的重点，可以通过相关细胞因子或化合物、基因修饰和共培养的方式诱导ESCs分化为肝细胞。Hamazaki最早表明ESCs在某些生长因子的培养基中可以分化并表达内胚层和肝特异性基因。Kania等在此基础上进一步研究，成功地诱导ESCs分化为胚胎干细胞源性肝祖细胞。体内实验中，ESCs源性肝祖细胞在肝损伤动物模型中能分化为肝细胞。但也有研究发现，体外培养分化出的肝细胞样细胞(hepatocyte-like cells，HLCs)的表型更加接近幼稚的胚胎肝细胞而不是成体肝细胞，在体内其可以分化得更加成熟。如果这些在体内促进细胞成熟的信号因子可以被提取，那么在体外培养成熟HLCs就成为可能。尽管ESCs诱导分化为肝细胞的研究给干细胞移植治疗提供了新的机遇，然而在此过程中，ESCs有发生恶变致畸胎瘤的可能；另外，ESCs的应用也面临着相关伦理学的争议和应用上的免疫排斥问题，这些都严重限制了ESCs的有效利用。
5.iPS细胞
iPS细胞是将维持胚胎干细胞多能性相关的一些核心基因(如Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28等)转导入非多能性的细胞(各种终末分化的体细胞或者成体干细胞)中后产生的类似多能性胚胎干细胞的特殊细胞类型。目前已经可以有效地将人iPS细胞在体外培养分化为肝细胞样细胞，但是其表型还是更加接近胚胎肝细胞。三维培养可以促进肝细胞样细胞发育成熟，以适应临床应用。最近的研究发现，将人类iPS细胞与内皮细胞和MSCs在体外共同培养，可以使iPS细胞分化为具有代谢和合成功能的肝细胞样细胞，并可以用来移植。
Song等将实验室建立的人iPS细胞系分化成肝细胞，分化所得的肝细胞和原代人肝细胞一样，表达肝细胞相关的分子标志，同时具备肝细胞的功能。诱导分化第7天，大约60%的iPS细胞表达肝细胞标志蛋白——甲胎蛋白和白蛋白，分化培养第21天时细胞显示肝细胞的功能特征，包括白蛋白分泌、糖原和尿素的合成、细胞色素P450酶的活性。Li和Gai等研究证明了小鼠iPS细胞可以在体外被诱导分化为功能性的肝细胞，体内注射实验也表明分化所得的肝细胞可以整合到受体小鼠肝实质中，具有正常肝细胞形态。Chiang等将iPS细胞移植入小鼠重型肝炎模型，有效地提高了小鼠的生存率。这些都提示iPS细胞可以作为乙型肝炎重症化肝细胞移植的新的细胞来源。虽然iPS细胞克服了ESCs面临的伦理学困境和免疫排斥问题，但还存在技术不完善、诱导分化效率低下、安全性以及机制不明等诸多问题，尚未进入临床试验阶段。
6.体细胞直接重编程来源的肝细胞
体细胞的直接重编程是指将一种成熟体细胞直接转变为其他类型的体细胞或者祖细胞。由于没有去分化、再分化等复杂过程，避免了细胞获得性免疫原性的问题，也不涉及伦理问题。这项技术同样在肝再生领域有着广阔的应用前景。2011年，Huang 等成功将小鼠尾成纤维细胞直接重编程为诱导性功能性肝细胞(iHeps)，该细胞具有与体内肝脏细胞类似的细胞形态和基因表达谱，同时获得了肝细胞的相关功能。同年，Sekiya等在体外将小鼠胚胎成纤维细胞和成体的成纤维细胞直接重编程为与肝细胞极为相似的细胞，并具有成体肝细胞的形态和功能特性。经过进一步改进的人诱导性功能性肝细胞(hiHeps)还作为生物人工肝的种子细胞，成功地缓解了小型动物猪的肝损伤，提高了生存率。邓宏魁研究组提出了一种全新的策略，模拟体内再生过程，提出了谱系重编程的新策略，成功地将人皮肤成纤维细胞诱导为具有成熟代谢功能的人诱导性功能性肝细胞，该种细胞可在肝损伤小鼠模型中高效重建肝功能。
重编程除了通过强制表达外源转录因子来实现基因的调控外，还可利用表观遗传抑制剂、核受体、化学小分子以及microRNA等改变细胞的命运。小分子化合物实现谱系重编程是一种更为安全可控的方式，是未来临床应用的方向之一。虽然目前对直接重编程的机制仍然所知甚少，但随着研究的不断深入，相信未来该方法可为临床肝细胞移植提供丰富的治疗细胞来源，在细胞移植领域的应用前景将非常广阔。
非肝源性肝相关干细胞的优点和缺点如表10-5所示。
表10-5非肝源性肝相关干细胞的优点和缺点
(三)移植途径
干细胞移植到肝脏可供选择的移植途径较多。有资料显示目前干细胞移植治疗肝病的临床试验中，有肝内注射及肝动脉、门静脉、周围静脉移植途径，其中肝动脉移植途径比例最高。理论上直接肝内注射移植是最佳的，但肝内注射会引起肝损伤，故临床难以实施。肝动脉移植是符合介入移植的动脉插管途径，可将细胞直接输注至肝脏，但从肝脏的组织超微结构来看，并不利于细胞向肝窦内迁移，且存在放射对比剂损伤引起肝肾综合征的危险。来源于门静脉移植途径的干细胞首过作用明显，此途径移植也更符合肝脏组织学及生理学特点，与其他途径相比，细胞更易进入肝窦。此外，从生理学角度看，门静脉是肝脏的营养静脉，门静脉血中的营养成分均对植入的细胞有益，肝脏本身的微环境也可调节植入细胞的分化，但其最大的缺点为移植细胞过多可能导致门静脉栓塞，也有加重门静脉高压的危险。周围静脉途径移植干细胞是临床治疗时应用最为广泛的通道，输注后肝组织甲胎蛋白和增殖细胞核抗原表达增加，提示肝组织增生增加。实验研究显示周围静脉途径移植干细胞可以到达肝门汇管区，有减少肝纤维化和改善生存的作用，并且避免了肝动脉和门静脉移植的风险。但周围静脉需要先经过肺部循环，因此它们的联系受到一定程度的削弱。不论何种移植途径，大多数研究认为移植后短期内细胞可整合到肝小叶中并分化为肝细胞样细胞，但对移植细胞的远期结局方面的研究较少。
(四)存在的问题与展望
虽然多项干细胞移植治疗肝病患者的临床研究显示了鼓舞人心的结果，但同时有许多相关问题需要解决，应切实做好基础研究工作：①干细胞体外分离、培养、鉴定等方面的技术尚未完全成熟；②干细胞分化演变的调控机制尚未完全阐明；③干细胞分化为成熟肝细胞和肝癌细胞的分水岭不明；④用何种干细胞做移植、最佳的移植数量、最有效的移植途径及临床疗效评价等均需要进一步研究；⑤需要合理设计多中心随机双盲对照临床研究验证疗效，并了解移植可能发生的副作用或并发症。
目前大多数研究还处在动物实验及部分临床前期研究阶段，但已有证据表明干细胞疗法有可能在乙型肝炎重症化方面取得较大的突破。相信随着对肝再生过程的进一步研究，以及干细胞在肝修复过程中作用的进一步了解，干细胞体外分离、纯化、扩增方法将不断成熟，解决干细胞体内归巢、定植、增殖等难题，进一步完善监测手段，建立和研究更多的临床研究模型，干细胞移植将会作为治疗乙型肝炎重症化的一种重要手段而广泛应用于临床。
四、其他细胞移植治疗
(一)概述
在前两个部分中我们系统地介绍了乙型重型肝炎的肝细胞及干细胞移植治疗的策略和进展。对于慢性乙型肝炎及乙型重型肝炎的细胞移植治疗方案还包括免疫细胞移植治疗。由于HBV感染发病是免疫介导的，同时病毒的清除有赖于机体免疫系统的作用。在慢性HBV感染者中，针对HBV的特异性和非特异性免疫功能呈免疫耐受状态，导致HBV在体内长期存在。随着细胞生物学、分子免疫学及生物信息学等学科的快速发展，国内外已经开展了相关的免疫细胞方法治疗病毒性疾病、恶性肿瘤以及自身免疫性疾病等，并取得了一定效果。
目前国内外应用于乙型肝炎治疗的免疫细胞疗法和制剂尚不成熟，亟须系统开发研究。打破免疫耐受，有效提高HBV特异性免疫应答，通过单独免疫治疗或联用其他抗病毒药物，有效抑制病毒复制，提高持久应答率或临床治愈率，减少终末期肝病的发生，最终大大降低HBV相关肝病的病死率。近年来国内外研究较多的疗法主要包括细胞因子诱导杀伤(cytokine induced killer，CIK)细胞治疗及树突状细胞(dendritic cell，DC)过继治疗。Hontscha等于2011年以“CIK细胞临床试验”为关键词在PubMed网站搜索到了867个匹配的结果，经验证，其中11项临床试验与CIK细胞治疗相关。这些临床试验共纳入426例患者，其中313例为男性，113例为女性。试验中的男性患者大多数患有肝细胞癌、胃癌等。在11项研究中有10项使用的是自体CIK细胞。注射的CIK细胞总数范围为21.9×107～5.2×1010。每次输注使用的CIK细胞数量范围为7.2×106～2.1×1010。患者最多接受40次CIK细胞输注治疗。有意思的是，在接受CIK细胞治疗的患者中乙型肝炎病毒(HBV)载量减少了。用CIK细胞治疗的患者无病生存率显著高于未用CIK细胞治疗的对照组。并且，CIK细胞治疗的副作用很小。人体感染HBV后，可引起细胞免疫及体液免疫应答，机体抗病毒免疫功能不足，尤其是HBV特异性T淋巴细胞功能缺陷是造成HBV感染慢性化的主要原因，因此，基于HBV感染致病机制的认识，恢复和提高慢性乙型肝炎患者的特异性和非特异性细胞免疫功能是控制HBV感染及疾病进展的可行方法。
(二)CIK细胞
CIK细胞是一类新型抗肿瘤效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖，与以往报道的一些抗肿瘤效应细胞相比，CIK细胞杀瘤活性更强、杀瘤谱更广。CIK细胞是单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养而获得的一群异质细胞，CD3+、CD56+细胞是主要的效应细胞。CIK细胞兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性与NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，与淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)相比，CIK细胞杀伤活性更强且杀瘤谱更广。
在治疗白血病的初步临床试验中，国内童春容等发现自体CIK细胞可以明显抑制甚至清除白血病患者体内HCV，患者肝功能不但没有加重反而明显改善。临床治疗的12例各类急性白血病患者均接受了反复化疗和造血干细胞移植。12例共接受22个疗程CIK细胞治疗，患者的血清HCV RNA在CIK细胞回输后2～3个月时转阴。CIK细胞治疗后肝功能指标逐渐下降或者肝功能指标较治疗前升高一段时间后下降。CIK细胞治疗后患者的肝功能对化疗的耐受性明显提高。陈红松课题组在1999—2003年期间，随机选择16例慢性乙型肝炎(CHB)患者用自体免疫活性细胞回输法治疗，追踪52周。在完整随访的14例患者中，4例治疗前后完成2次肝穿刺活检，其中1例显示治疗后肝细胞坏死和小叶内炎症程度明显减轻，纤维化程度改善，其余3例肝脏组织学变化不明显，但无加重或恶化。经过52周随访，14例患者中有6例HBV DNA转阴。抗HBe血清转化和ALT正常化比例为42.86%。没有出现治疗相关的严重不良反应。自体CIK细胞过继免疫治疗不会导致慢性乙型肝炎患者明显的肝损伤，同时可通过非细胞毒性机制抑制HBV复制。除此之外，在对CHB患者的治疗研究中，施明等观察到CIK细胞对CHB患者的治疗作用与其免疫状态有关。CIK细胞治疗对处于不同免疫状态的患者效果不相同，对处于活化期的患者效果要优于免疫耐受期患者，并且对抗病毒药物产生耐药的患者也有明显抑制病毒的作用。
临床动态观察CHB患者CIK细胞的增殖及杀伤活性发现，患者CIK细胞的增殖和杀伤活性均低于正常人。推测CIK细胞可能通过以下机制发挥抗HBV的作用：①体外培养CIK细胞过程中采用的CD3单抗(mAbCD3)及IL-2等细胞因子直接激活扩增CIK细胞，回输后直接杀伤病毒感染细胞；②研究显示mAbCD3及IL-2激活的T淋巴细胞分泌多种细胞因子如IFN-γ、IL-2等。这些细胞因子可直接渗透到细胞内，抑制或杀伤病毒，或通过改善体内的细胞因子环境，上调病毒感染细胞的MHC分子及其共刺激分子的表达，激活扩增病毒特异性CIK细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等，从而清除病毒。与前者相比，这种作用占主导地位。
(三)DC过继治疗
DC是起源于骨髓的专职抗原呈递细胞，具有启动由T淋巴细胞介导的免疫应答功能，因其表面具有众多树突状突起而得名。DC由美国学者Steinman及Cohn于1973年发现。自从1992年Steinman建立了应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)从小鼠骨髓中大规模培养制备DC的方法后，人们又建立并完善了多种培养扩增DC的方法，对DC的研究得以深入。DC在感染免疫应答中具有重要作用，并在肿瘤免疫治疗、器官移植和慢性乙型肝炎的治疗中引人注目。DC治疗慢性乙型肝炎原理如图10-2所示。
图10-2DC治疗慢性乙型肝炎原理
抽取慢性乙型肝炎患者外周静脉血，于实验室分离单个核细胞，体外诱导培养DC，将DC负载抗原或经基因修饰后，通过皮下或静脉回输给患者。
研究发现，由于慢性HBV感染者外周血树突状细胞(PBDC)或单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)存在表型和功能缺陷，主要包括：①成熟DC的表面标志(如HLA-Ⅱ类分子、CD80与CD86等)表达下降；②DC产生IL-12不足；③同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)中DC刺激T淋巴细胞增殖及产生细胞因子(如IFN-γ等)的能力降低，或同时有NO水平增高；④对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或核心抗原(HBcAg)的应答过程中，DC的成熟表型及特异性T淋巴细胞增殖缺陷；⑤诱导CTL不足。所以，近年来，研究者通过多种方式直接或间接恢复和增强DC的抗原呈递功能：①细胞因子(如IL-12、IFN-γ、IFN-α等)体内外的作用；②乙型肝炎疫苗体内刺激；③DC体外诱导和抗原冲击或基因修饰后回输DC疫苗；④优化、增强DC摄取功能的DNA疫苗。DC用于病毒的免疫治疗主要是通过体外病毒抗原冲击致敏DC，再回输体内，诱导出病毒抗原特异性CTL，杀伤病毒感染的细胞。用抗原致敏DC的方法有多种：可通过病毒抗原肽或蛋白直接冲击DC；用灭活的病毒疫苗共同温育；还可用阳离子脂质体携带病毒蛋白或合成的双链RNA冲击，但最常用的方法仍然是用病毒抗原多肽致敏DC。吴邦富教授在2013年第48届欧洲肝脏研究学会年会上的研究报告指出：动物实验已证实DC治疗能打破HBV的免疫耐受。在一项HBsAg、HBcAg致敏的DC治疗慢性乙型肝炎患者的临床试验中，380例患者接受DC治疗48周后，HBeAg阳性者HBsAg血清学转阴率达到29.73%，HBeAg阴性者HBsAg血清学转阴率为10.26%，远远高于现有的抗病毒治疗方案。而在另一项HBsAg致敏DC活化混合T淋巴细胞联合替比夫定治疗慢性乙型肝炎患者的临床试验中，治疗24周患者HBeAg血清学转阴率即可达到45.65%。这些研究结果显示了DC治疗慢性乙型肝炎的潜力，慢性乙型肝炎的临床治愈并非不能实现，但由于人体内DC数量有限，DC来源主要有体外诱导及体内诱导两种策略。体外诱导一是将外周血单核细胞诱导为DC，目前DC治疗主要采用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4来诱导；二是促使骨髓细胞转化为DC，但多局限于动物研究。体内诱导一是促进未成熟DC的成熟，如TLR配体、抗原等；二是动员DC的生成，如Flt3L等。HBsAg致敏的DC活化混合淋巴细胞联合核苷(酸)类似物或PEG-IFN-α治疗CHB的临床试验可能为HBV感染的治疗提供新的数据。
CIK细胞和DC治疗是免疫治疗的重要组成部分，两者联合可以提高免疫应答效率。因此，对DC共培养的CIK细胞(DC-CIK细胞)的研究将成为细胞免疫治疗的重点。随着细胞制备技术的日趋完善，DC-CIK细胞过继治疗在临床逐渐开展，多种肿瘤相关的细胞免疫治疗应用及疗效评估已陆续有报道。Marten等将外周血来源的CIK细胞和同源DC共培养一段时间后发现，DC和CIK细胞的增殖能力明显增强，共培养14天后CIK细胞的增殖倍数比共培养7天时高出2倍左右。共培养24天后，DC中IL-12的分泌量为单独培养时的6.93倍，与DC共培养的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性显著提高。近期，国内许多学者观察了不同来源的DC与CIK细胞共培养后DC-CIK细胞的表型、体外增殖和细胞毒性的变化，相关报道均支持Marten的实验研究，认为DC和CIK细胞共培养可以同时促进CIK细胞和DC的增殖和免疫功能。
(四)存在问题及展望
对于DC-CIK细胞治疗慢性乙型肝炎或乙型重型肝炎的研究目前在国内虽有小规模开展，但是该研究仍处于起步阶段，尤其是DC-CIK细胞治疗的适应证、免疫细胞给予的时间及频度目前都尚不明确。随着对慢性乙型肝炎及乙型重型肝炎患者免疫变化规律的进一步明确，患者免疫治疗过程中免疫监测手段的进一步完善，并通过大规模临床多中心研究评价，DC及CIK细胞移植也将会作为治疗慢性乙型肝炎及乙型重型肝炎的一种重要手段而应用于临床。
五、细胞移植治疗中的基因修饰
(一)概述
细胞移植治疗之前对移植细胞进行基因修饰是获得理想治疗效果的有效途径。近年来，随着基因治疗的进展，越来越多的项目进入临床试验及临床治疗中。在移植细胞制备的环节中，涉及诸多的基因修饰问题。目前，基因修饰技术已被大量运用于细胞移植从而产生具有更好特异性及治疗潜能的细胞类型。但是限制细胞移植治疗中基因修饰技术应用的主要瓶颈为基因传递系统。
细胞移植联合基因修饰由于其有效性、特异性和安全性而大大加强了治疗效果。本文着重讨论基因转移技术中所用到的载体及其局限性。人类基因转移的一个重要应用领域是移植代谢活跃的细胞，如肝细胞或胰岛细胞。这些细胞分裂得非常慢，因此要求所使用的基因转移载体能够转导静止期细胞。基因转移策略的关键是实现治疗基因到移植细胞的高效率传递。在基因传递策略上已经进行了大量的研究，包括病毒和脂质体转移、电穿孔及直接DNA注射。最近提出的将目的基因转移到分化细胞的方法主要是利用细胞的高增殖能力，如胚胎干细胞(ESCs)，这是因为ESCs通过基因转移技术可以直接分化成所需要的细胞。基于近期的这些发展动态，我们以后将重点关注细胞移植和基因修饰技术的应用。
(二)肝细胞移植中的基因修饰
肝细胞移植技术是将分离出的供体正常肝细胞通过脾动脉、门静脉、脾脏或腹腔内注射移植于受体体内以替代部分病肝功能的方法。肝细胞移植近年在治疗慢性肝炎、肝脏遗传代谢性疾病和急、慢性肝衰竭等疾病方面取得了长足进展。虽然移植的肝细胞具有相对较容易获取、可进行冻存、回输简便等优点，但是其进一步的临床应用仍受到许多环节的限制。例如，同种异体肝细胞移植中受者体内排斥反应、供体肝细胞移植后增殖能力有限等因素可导致所移植的肝细胞发挥极低的替代作用，从而无法阻断或逆转肝衰竭的疾病进程。而通过基因修饰技术调控相关基因表达或利用载体在移植肝细胞内导入外源基因，调控抗排斥反应，促进移植肝细胞增殖，以及抑制移植肝细胞的免疫排斥反应成为肝细胞移植研究领域中的重要方向之一。
促进并维持移植肝细胞在受体内的增殖功能，对提高肝细胞移植的治疗效果和临床进一步应用有极其重要的意义。对细胞周期调控基因的干预，可使移植肝细胞增殖数量明显增加，显著延长小鼠平均生存期。将血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因导入移植肝细胞则可以促进移植肝细胞周围毛细血管组织的形成，有利于移植肝细胞的存活与再生。通过免疫抑制相关基因的修饰，如腺病毒介导CTLA-4 Ig基因转染肝细胞则可实现对受体的免疫排斥反应的抑制，抑制移植肝细胞的免疫排斥反应。
(三)肝相关干细胞移植中的基因修饰
基于干细胞的多向分化能力，基因修饰的干细胞治疗与传统的基因治疗相比有明显的优势。以往肝相关干细胞基因修饰治疗的研究主要集中于遗传代谢性疾病。例如，用重组腺相关病毒携带α抗胰蛋白酶基因，导入小鼠的肝祖细胞治疗α抗胰蛋白酶缺乏小鼠，5%～10%的阳性干细胞重新分群，可以持续表达α抗胰蛋白酶18周。近年来，孙超等将尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞移植入四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠，发现其能诱导肝细胞增殖，进而改善肝功能。IL-10基因修饰骨髓源性肝干细胞移植能有效减轻肝内炎症，促进肝细胞再生，并减少肝纤维化大鼠细胞外基质的积聚。这些研究为基因修饰干细胞治疗肝纤维化提供了新思路。
(四)免疫细胞移植中的基因修饰
DC作为最有效的抗原呈递细胞，在启动和维持特异性T淋巴细胞免疫中起重要作用。而慢性乙型肝炎患者DC功能缺陷是导致宿主特异性T淋巴细胞免疫耐受、HBV持续感染的主要因素。患者慢性HBV感染时，DC 的数量明显减少，其表面共刺激分子CD83、CD86 表达水平也明显低下，DC摄取抗原能力下降，并且出现成熟障碍。近年来，直接或间接恢复和增强DC抗原呈递功能成为过继回输免疫治疗慢性肝炎的主要策略。目前，增强慢性肝炎患者DC功能的策略主要如下：①通过细胞因子(如IL-12、IFN-γ、IFN-α等)体内外的作用，或细胞因子基因修饰DC(如IL-12、IL-18等细胞因子进行DC修饰)，上调DC抗原呈递功能；②乙型肝炎疫苗体内刺激；③DC体外诱导和抗原冲击，或抗原基因修饰DC后回输(如通过腺病毒携带HCV非结构蛋白基因进行DC修饰)；④优化、增强DC摄取功能的DNA疫苗；⑤上调DC共刺激分子表达，或共刺激分子基因修饰DC(如利用HBV S抗原基因联合CD40L融合基因进行DC修饰，增强DC抗原呈递作用以及活化)。在上述策略中，多个环节涉及针对DC的基因修饰。
治疗病毒性肝炎领域的Antonio Bertoletti教授及其团队在世界上率先使用了mRNA转导方法，重建乙型肝炎特异性TCR导向T淋巴细胞，用于慢性乙型肝炎患者的治疗。慢性HBV感染患者体内特异性T淋巴细胞在数量和功能上都有缺陷。所以，清除HBV的关键，在于恢复慢性感染患者体内HBV特异性的T淋巴细胞免疫。该研究利用分子生物学技术来修饰患者的T淋巴细胞。当经过 TCR修饰的T淋巴细胞回输到患者体内时，T淋巴细胞会找寻和识别感染肝细胞，抑制病毒感染或清除病毒。为实现这一点，首先需要分离和识别出特异性乙型肝炎的T淋巴细胞，提取遗传信息。长期目标是尝试使用这种特异性的耐受慢性乙型肝炎T淋巴细胞抗原，以从根本上尝试重建对病毒特异的免疫系统。研究提出了控制慢性HBV感染的新策略，可彻底清除，并有可能治愈此类病毒所导致的慢性乙型肝炎。
(五)基因修饰病毒技术
目前，有关基因治疗载体的开发取得了一些进展。病毒载体系统是较为广泛使用的基因转移系统。它包括具有整合能力的病毒载体(如逆转录病毒、腺相关病毒及慢病毒等)和不具有整合能力的病毒载体(主要为腺病毒)。两者相比，腺病毒载体容易生产，且滴度高，能高效地转染多种类型的细胞，但有明显的局部组织炎症和较强的免疫反应，限制了转基因表达的持续时间。而逆转录病毒载体只能感染分裂细胞，其随机整合有引起癌基因激活的潜在可能性，使其安全性成为难以解决的问题。慢病毒载体整合稳定性强，目的基因表达时间长，但同样具有安全性问题。腺相关病毒载体是较有前途的载体，它可以有效而稳定地转染分裂细胞和非分裂细胞，且其内源性弱启动子对外源基因的调控无明显的干扰作用，启动方向不指向宿主细胞DNA，因此通过插入病毒启动子而激活细胞原癌基因的可能性极小。目前，选择合适的病毒载体主要取决于其转染率和持续表达目的基因的时间。以上载体各有优劣性，最理想的病毒载体还有待进一步的研究和开发。
1.逆转录病毒载体
最初，逆转录病毒载体是从γ-逆转录病毒发展而来的，主要是莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)。重组逆转录病毒载体由一个治疗性表达盒组成，该表达盒两侧是两个长末端重复序列，可以提供包装、逆转录和整合信号。逆转录病毒在迅速分化的细胞中有很强的感染力，且所转入基因可以长期表达，这是由于前病毒DNA整合到了细胞基因组中并在随后的细胞后代中稳定地表达。到目前为止，逆转录病毒载体是转基因治疗免疫缺陷疾病、血液系统和中枢神经系统紊乱疾病中应用最广泛的载体。由于基因在转移到干细胞后具有较强的增殖能力，因此逆转录病毒载体有望用于治疗遗传性单基因失调症，如严重联合免疫缺陷病(SCIDs)。然而，成熟细胞具有低的增殖能力，因此刺激这些细胞的增殖是利用逆转录病毒成功地进行感染而达到治疗目的的关键。
逆转录病毒载体除了可以成功地转导干细胞外，还可以转移治疗基因到免疫细胞、表皮干细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等中。逆转录病毒载体由于可以大大降低插入突变的风险而在基因治疗的研究中越来越受到青睐。德国慕尼黑工业大学病毒研究所Krebs等尝试在体外通过逆转录病毒载体使CD8+T淋巴细胞表达能与HBV包膜蛋白结合的嵌合抗原受体(S-CAR)，随后将表达S-CAR的CD8+T淋巴细胞被动转入HBV转基因小鼠体内。结果显示，表达S-CAR的CD8+T淋巴细胞能识别多种HBV亚型，能被成功植入免疫健全的HBV转基因小鼠，并在小鼠体内扩增。这些T淋巴细胞主要定位在肝，并在肝内发挥功能，能迅速有效地控制HBV复制，仅引起一过性肝损伤。该研究提示，循环中的大量病毒抗原并不削弱或过度活化这些植入的表达S-CAR的CD8+T淋巴细胞。这种免疫细胞疗法不受人白细胞抗原限制，可加以开发用于人类。强有效的T淋巴细胞应答是清除HBV所不可或缺的，但这也恰好是慢性乙型肝炎患者所欠缺的。
2.慢病毒载体
慢病毒属于逆转录病毒的子类，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)，此类病毒能够感染非分裂细胞并且具有较高的效力。没有复制能力的慢病毒的产生机理与其他病毒的产生机理几乎相同。来自HIV的gag和pol基因，或rev基因都是慢病毒复制所必需的。病毒颗粒由来自其他病毒的包膜蛋白所包裹，如水疱性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)。VSV-G包膜蛋白使慢病毒粒子成为广谱敏感细胞型。完全缺失HIV致病基因赋予慢病毒介导的基因转移很高的安全性，从而不用担心HIV的致病性。类似于逆转录病毒载体，慢病毒载体能够整合到受体细胞的基因组中，从而使转入的基因能够在体外稳定地表达。这些载体可携带多达9 kb的外源基因，并且已经成功地将基因转移到肌细胞、造血干细胞、神经细胞及胶质细胞中。
类似于逆转录病毒载体，慢病毒载体也是一个整合载体，将载体基因组整合到受体基因组中可以为持久改善遗传性疾病提供一个长期的转基因表达量。然而，整合可能会影响到内源性基因的表达，内源性基因的活性也可刺激或抑制转入基因的表达，也就是说，整合表达盒可被内源性转录因子或增强子所控制。因此，对病毒整合的控制可以提高慢病毒载体的安全性。
3.腺病毒载体
腺病毒(AdV)载体是一种很好的病毒载体，可将基因转移到代谢活跃且具有低增殖能力的细胞中。AdV载体具有较高的装载量，可以提供约30 kb的外源基因，可以传递一个以上的基因治疗表达盒，因此含有转录增强因子的治疗性基因和其他协同基因可以同时进行转导。此外，高滴度的AdV载体很容易生产，这对进行体内转导需要大量的病毒是非常有价值的。然而，AdV可以触发强烈的免疫反应，并且转入基因的表达往往很短暂，这是由于它们在细胞中以非整合的形式存在。
单纯疱疹病毒(HSV)载体也可以装载较大的外源基因，但转入基因的瞬时表达限制了这些载体在基因疗法中的应用。HSV载体的进一步发展可以延伸它在基因疗法中的应用。
4.腺相关病毒载体
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科家族的一员。它是一种单链的、复制缺陷型的DNA病毒，其DNA由两个基因组成，可以编码四个复制蛋白和三个衣壳蛋白。该病毒基因组的两侧是两个145 bp的末端反向重复序列(ITR)。野生型2型AAV能借助其rep基因整合病毒基因组到人第19号染色体的某一特定位点。AAV似乎并不在人体内引起疾病；AAV介导的外源蛋白可以永久表达，这是由于AAV具有较低的免疫反应，缺乏触发破坏性的细胞毒性淋巴细胞抵抗转导细胞的能力从而使病毒基因组持久存在于细胞中。此外，AAV还能高效转导分化和非分化的细胞。重组AAV(rAAV)是通过将治疗表达盒(加边以完整的顺式作用于ITR)替代野生病毒基因组而构建的。病毒感染后，rAAV可以实现转基因的持续表达，在rAAV中缺少rep基因，因此它不能整合到宿主细胞的基因组中。但大多数研究表明，rAAV在细胞核里有一个稳定的遗传形式，从而能够长期存在并能使转基因持久表达。虽然rAAV载体看起来是基因转移的最佳病毒载体，但rAAV载体仍存在缺点，那就是其转基因能力有限，它不能有效地装载超过4.7 kb的外源基因。
5.非病毒基因转移载体
虽然病毒载体能够有效地转导细胞，但病毒基因在体内的转录以及这些基因整合到宿主基因组中的风险仍然存在。此外，病毒颗粒的生产需要专业的技能和人员。非病毒载体，如质粒，是很容易得到的，并且可以经脂质体转移或电击法而递送到细胞中，对人体也是安全的。利用非病毒载体成功地转染细胞，尤其是阳离子脂质，已经在细胞移植治疗中实现。通过阳离子脂质来实现治疗基因转导胰岛的体外操作已经在猪胰岛细胞中建立。电穿孔技术可以用来传递核酸片段、寡核苷酸、小分子干扰核糖核酸(siRNA)及质粒到细胞中。目前已经完成了对体内电穿孔技术的研究，但是研究者们发现电击通常会对分化的成熟细胞造成伤害。由于非病毒基因转移在很多案例中表现出低效率或者造成严重的膜损伤，因此发展安全高效的非病毒基因转移载体作为新一代的基因治疗载体将是非常有益的。
非病毒基因转移的理想宿主细胞是具有增殖能力和自我更新潜能的细胞。因此，胚胎和成熟干细胞被看作非病毒技术的重要细胞来源，它们可以产生大量的细胞且具有高的移植能力和繁殖能力，因此它们在细胞替代疗法中有着显著的优势。
6.细胞来源
胚胎和成熟干细胞被看作细胞替代疗法中的主要细胞来源。但是在再生医学中应用人胚胎干细胞(hESC)受到一些伦理和法律限制，因此成熟干细胞成为一个很有吸引力的选择，因为它们不存在上述问题并且自体移植是可行的。然而，这些细胞似乎并不具有多向分化潜能，因此目前研究的重点是建立转基因修饰胚胎干细胞和胚胎干细胞体系，以便在体外生产它们的可移植的组织特异性诱导物。(https://www.daowen.com)
由于转基因操作的可行性，ESCs有望成为很有前景的细胞来源，并且满足下列要求：①大量的目标细胞将传递给患者并确保显著的治疗效果；②用于移植的组织特异性细胞培养物必须从未分化的高致瘤性胚胎干细胞中完全纯化出来；③供体细胞必须具有很高的移植能力和存活能力，最好能够增生以恢复受赠器官的功能；④移植细胞应当具有自体免疫能力。
(六)存在的问题及研究展望
基因修饰的细胞移植治疗重型肝炎虽然还处于实验研究阶段，但已显示出巨大的优势。当然，将其应用于临床还需要解决许多问题，如基因转染的效率低、病毒载体的安全性尚未确认、基因转染可能对宿主细胞生物学特性产生影响(激活原癌基因导致恶变)、目前的技术尚不能对基因的表达进行精确的负反馈调控等。相信随着对基因修饰技术的深入研究、载体制备技术的完善、理想目的基因的不断出现、基因表达可控性的进一步提高，基因修饰的细胞移植治疗工程必将得到广泛的应用。
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