乙型肝炎重症化和乙型重型肝炎(肝衰竭)的其他治疗
赵西平 王文涛
乙型肝炎重症化和乙型重型肝炎(肝衰竭)，是在HBV因素(如病毒载量、变异、进化、重叠感染等)和宿主因素(如遗传异质性、年龄、性别等)基础上，由免疫因素介导的大量肝细胞死亡所导致的严重肝功能损害。在过去的20年中，针对HBV的抗病毒治疗，包括人工肝在内的对症支持治疗以及肝移植已显著改善了乙型重型肝炎患者的预后。然而，乙型重型肝炎病死率高，上述治疗措施仍难以令人满意，研究更为有效的干预手段已成为目前关注的热点。随着对乙型重型肝炎(肝衰竭)分子病理机制的了解，未来开发更为有效的治疗措施成为可能。尤其需要注意的是，肝细胞具有显著的再生能力，乙型肝炎重症化和乙型重型肝炎(肝衰竭)的这种治疗有利于为自身肝细胞的恢复争取时间。此外，鉴于其独特的结构及组织学特征，肝脏有可能是一些治疗措施优选的靶点。肝脏由门静脉和肝动脉双重供血，血供丰富，能够实现转基因产品或药物的快速分布；各级胆管形成导管网络，使多种肝毒性物质排入小肠，有助于提高某些治疗的效果；肝脏由多个生理性分割(肝段或肝小叶)构成，能够实现局部治疗的安全性隔离；肝细胞相对容易分离与纯化，可体外进行基因修饰，然后回输基因修饰后的肝细胞至患者体内进行治疗。
一、抑制肝细胞的凋亡
肝细胞的凋亡和坏死性凋亡在慢性重型肝炎的发生与发展中起着非常重要的作用。细胞凋亡的途径主要有两条：死亡受体介导的凋亡通路，包括FasL/Fas凋亡通路、TNF-α/TNFR凋亡通路和TRAIL/TRAIL-DR凋亡通路，以及线粒体依赖的凋亡通路。因此，干预上述凋亡通路的关键分子，抑制细胞凋亡，未来有可能成为乙型重型肝炎患者的治疗方向。
1.FasL/Fas凋亡通路
Fas(APO-1/CD95)属于肿瘤坏死因子受体家族，结构性表达于肝脏，并通过与Fas配体(FasL)结合诱导肝细胞的凋亡。FasL/Fas信号转导途径在急性肝衰竭的发生和发展中起着非常重要的作用。为了靶向肝脏Fas的表达，Kuhla等人构建了Fas siRNA的肝脏特异性siRNA载体系统(DBTC/siRNA-Fas)。在内毒素诱导的肝衰竭小鼠模型中，静脉注射DBTC/siRNA-Fas改善了肝脏微血管的灌注，减轻了肝细胞的凋亡和坏死，并提高了小鼠的生存率。在另一项研究中，Al-Saeedi等人证明了通过FasL中和抗体来阻断FasL/Fas通路也能够有效地保护小鼠避免缺血再灌注所致的急性肝衰竭。
2.TNF-α/TNFR凋亡通路
TNF-α通过与其受体——TNFR1或TNFR2结合发挥作用，以诱导肝细胞的凋亡。此外，TNF-α能够通过激活JNK、Bim的磷酸化和NF-κB通路上调FasL的表达，从而使肝细胞对FasL诱导的细胞凋亡的敏感性增加。在乙型重型肝炎患者的血清和肝组织中，TNF-α的表达水平显著升高。在一项开放性的临床试验中，共纳入了19例接受英夫利昔单抗(infliximab，一种TNF-α的单克隆抗体)治疗的重型酒精性肝炎患者，与基线相比，英夫利昔单抗治疗明显改善了患者的Maddrey和MELD评分。在另一项随机、双盲、安慰剂对照的多中心临床试验中，评估了依那西普(etanercept，一种TNF-α的单克隆抗体)对重型酒精性肝炎患者的疗效，依那西普治疗组的6个月病死率较安慰剂组更高，严重感染是其治疗失败的主要原因。
3.TRAIL/TRAIL-DR凋亡通路
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)表达于活化的T淋巴细胞、NK细胞等，与靶细胞表面死亡受体DR4/DR5结合可诱导细胞凋亡。随着慢性乙型肝炎的急性发作，IFN-α和IL-8水平显著升高，其分别导致肝脏中NK细胞表达TRAIL以及肝细胞表达TRAIL-DR4/DR5的水平上调，通过TRAIL/TRAIL-DR依赖的途径促进肝损伤。在一项临床前研究中，Chen等人评估了可溶性DR5-Fc融合蛋白(sDR5-Fc，其能够阻断TRAIL的活性)在治疗急性肝衰竭中的药代动力学、安全性及疗效。在ConA诱导的急性肝衰竭模型中，sDR5-Fc治疗抑制了TRAIL诱导的细胞凋亡及肝脏炎症，从而显著地改善了小鼠的生存率。与未基因敲除的小鼠相比，TRAIL敲除的小鼠在ConA注射后也显示出更低的产生IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平。此外，无论单次1200mg/kg还是多次100mg/kg注射，sDR5-Fc治疗在猕猴中均显示出良好的安全性及耐受性。
4.线粒体依赖的细胞凋亡通路
在DNA损伤、细胞缺氧等条件下，Bcl-2、Bcl-xL、Bax等促凋亡蛋白在线粒体膜中形成离子通道，膜通透性发生改变，使细胞色素c、AIF、SMAC、Endo G、Ca2+以及膜间隙中的pro-caspase等凋亡因子释放到细胞质中，激活caspase-3、caspase-9，或使染色质凝缩、大规模DNA片段化，或作用于其他Ca2+依赖蛋白破坏细胞的整体结构，最终导致细胞凋亡。在一项研究中，组蛋白脱乙酰酶-2抑制剂CAY10683能够抑制线粒体依赖的细胞凋亡途径，从而在内毒素诱导的肝衰竭中发挥保护作用。
二、控制炎症反应
1.核因子-κB
核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)在调控炎症反应、免疫应答及细胞应激中发挥着关键性作用。在正常条件下，NF-κB二聚体与抑制因子IκB结合，以无活性的状态限定在细胞质中。在刺激状态下，IκB激酶活化，使IκB亚基调节位点的丝氨酸磷酸化，导致IκB亚基被泛素介导的蛋白酶降解，进而释放NF-κB进入细胞核，启动多种基因的转录进程。NF-κB的激活促进IL-1β、IL-6等多种炎症因子的产生，加重肝损伤。在小鼠模型中，抑制NF-κB的信号途径已成为多种临床前药物治疗肝衰竭的关键，如AGK2、miR-223和A20。因此，NF-κB可作为乙型重型肝炎患者治疗的靶点。
2.炎症小体
炎症小体(inflammasome)是由多种蛋白质构成的复合体，包括感受器分子(如NOD样受体、AIM2及RIG-I样受体)、效应分子pro-caspase-1，伴或不伴有适配体分子ASC。炎症小体能够识别病原相关分子模式(PAMPs)或宿主来源的损伤相关的分子模式(DAMPs)，招募和激活蛋白酶caspase-1，进而切割IL-1β和IL-18的前体，生成相应的成熟细胞因子。此外，一些非经典的炎症小体通路能够激活caspase-11，触发IL-1α 和HMGB1的分泌以及细胞凋亡。炎症小体的激活参与了多种肝病的发生与进展过程，如药物诱导的肝损伤、病毒性肝炎等。在小鼠重型肝炎模型中，ROS/NLRP3/IL-1β轴过度激活，在MHV-3诱导的肝脏炎症反应中发挥着关键作用。最近的一项安慰剂作为对照、多中心、双盲的Ⅱ期临床试验评估了emricasan(一种pan-caspase抑制剂)在急性肝硬化失代偿患者中的药代动力学、安全性及临床效果。Emricasan在这些患者中是安全的且耐受性良好，但是未显示出理想的治疗效果。
3.高迁移率族蛋白B1(HMGB1)
高迁移率族蛋白B1(HMGB1)，最初报道为普遍存在的非组蛋白染色体蛋白，是一种多功能蛋白，其功能取决于它的位置(细胞核、细胞质或细胞外空间)。细胞外的HMGB1作为一种炎症介质已被广泛地研究，且在急性或慢加急性肝衰竭中，血清HMGB1的水平显著升高。多种以HMGB1为靶点的治疗，包括针对HMGB1的单克隆抗体、化学引诱剂、吸附和基因沉默，在小鼠肝衰竭模型中均显示出较好的治疗效果，未来有可能进入临床成为慢性重型肝炎的治疗选择。
4.IL-33/ST2信号通路
IL-33属于IL-1家族，作为一种DAMPs，启动潜在的免疫反应以加重肝损伤。与慢性乙型肝炎患者和健康人相比，HBV所致慢加急性肝衰竭患者的外周血和肝组织中IL-33/ST2的表达水平明显升高，且外周血中可溶性ST2的水平与预后呈负相关。机制上，IL-33能够通过激活ERK1/2增强LPS所致单核细胞的炎症“风暴”。IL-33/ST2在HB-ACLF患者外周血和肝脏中的表达水平明显高于CHB患者和对照组。然而，IL-33/ST2信号通路的作用取决于肝损伤发生的背景。ST2敲除的小鼠加重ConA诱导的肝损伤，其作用机制可能与IL-33通过结合其受体ST2诱导Th2型细胞因子的产生有关。
三、促进肝脏的修复与再生
正常的肝组织具有巨大的自我更新和再生潜力。在肝部分切除或肝损伤之后，正常状态下静止的肝细胞能够被激活并进入增殖状态。当肝脏受到更大程度的损伤时，肝脏祖细胞(hepatic progenitor cell，HPC)被激活，执行二线的再生反应。因此，HPC的激活取决于肝细胞损伤的严重程度和残余肝细胞的增殖活性。通过分析不同类型肝衰竭患者的肝组织标本，Rastogi等人发现急性肝衰竭患者肝细胞的增殖最为活跃，而慢加急性肝衰竭(ACLF)患者HPC的激活最明显。与ACLF患者相比，肝硬化失代偿患者HPC的分化能力较差。研究也证实，肝脏的再生能力与乙型重型肝炎患者的预后呈明显的正相关。乙型重型肝炎患者的肝脏再生功能受损，其原因尚不十分清楚，可能与肝细胞损伤过重、肝细胞凋亡较快、肝细胞刺激因子的相对缺乏以及增殖相关基因表达下调有关。此外，慢性肝细胞的损失则导致肝细胞持续增殖，且常常伴随着不良的预后，如发展为肝硬化或肝癌。
1.促再生信号通路
重建受损的成人肝脏需要一系列高度保守的信号，这些信号在胎儿时期协调器官的发生中也起着重要作用。通过检测细胞外刺激引起的细胞内信号通路的激活，先前的研究证明Wnt、Notch、YAP、VEGF、IGF-1等信号通路参与了肝脏发育以及肝损伤的修复。以Wnt/β-catenin信号通路为例，Wnt/β-catenin信号驱动目标基因的表达，促使静止的肝细胞进入细胞周期进程，触发肝脏的再生活动。无论是利用肝脏过表达β-catenin的小鼠，还是外源性传输Wnt-1到肝脏，均表明了Wnt/β-catenin信号通路有可能成为乙型重型肝炎的治疗靶点。在一项研究中，lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进细胞周期进程和肝细胞增殖，从而有利于肝脏再生。
2.干预再生抑制通路
转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一种负调控因子，广泛参与体内各种病理生理过程，与炎症、创伤、器官纤维化、肿瘤等的发生、发展关系密切。TGF-β调节细胞的生长与分化，诱导细胞凋亡，从而在肝脏再生中发挥抑制作用。此外，作为长期肝损伤的结果，高水平的TGF-β能够导致肝星状细胞的激活，促进肝纤维化与肝硬化的发展。作为一种潜在的TGF-β1的激活因子，血浆TSP-1的水平与肝切除术后的肝损伤呈相关性。抑制TSP-1/TGF-β信号通路能够加速肝切除术后的肝脏再生，所以也有可能成为慢性重型肝炎的治疗措施。
四、阻止线粒体损伤和氧化应激
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子，如活性氧自由基(ROS)和氮自由基(RNS)产生过多，机体氧化程度超出其清除能力，体内氧化与抗氧化稳态失衡，导致炎性细胞浸润以及组织损伤。HBX蛋白通过招募DNA甲基转移酶DNMT3A诱导NQO1的表观沉默，进而损伤线粒体功能，且使肝细胞对氧化应激诱导的细胞损伤的敏感性增加。线粒体损害引起线粒体DNA(mtDNA)的损伤与损耗，并造成mtDNA的释放。广泛的mtDNA损伤诱导线粒体氧化应激，进而促使肝细胞的损伤。当mtDNA离开线粒体的限制进入细胞质或细胞外环境中，它可作为一种DAMPs，通过Toll样受体-9、炎症小体、STING等信号通路触发炎症反应，进一步加重肝细胞的损伤，甚至远处器官的损伤。氧化应激标志物——血浆丙二醛加合物与HBV相关的慢加急性肝衰竭的严重程度呈正相关，而谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)的启动子甲基化促进氧化应激引起的肝损伤。因此，阻止线粒体损伤和氧化应激有可能在早期干预乙型重型肝炎的发生与在进展中起到作用。
五、调节内质网应激反应
内质网应激表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱，可激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和caspase-12介导的凋亡通路等信号途径。通过比较正常人、慢性乙型肝炎及慢性乙型重型肝炎患者的肝组织标本，Ren等人观察到内质网应激失调参与乙型肝炎重症化的过程。内质网应激还通过激活蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)上调炎症小体成分NLRP3的表达，而激活法尼酯X受体(FXR)的治疗，如miR-186 和它的靶点NCK1，能够抑制内质网应激介导的该信号途径，从而减轻肝细胞死亡和肝损伤。在兔出血热病毒诱导的急性肝衰竭模型中，褪黑素可抑制内质网应激和未折叠蛋白反应，并起到肝脏保护作用。
六、诱导细胞自噬
自噬(autophagy)是细胞在自噬相关基因的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，对实现细胞代谢需要、更新某些细胞器及维持细胞内稳态具有非常重要的作用。在急性肝衰竭状态下，严重细胞应激及过量活性氧的产生会激活自噬，而自噬能缓解氧化应激所产生的组织损伤。在内毒素诱导的急性肝衰竭模型中，自噬相关基因Eva1a/Tmem166的肝脏特异性敲除，影响自噬的激活并加重肝损伤，而诱导自噬的产生则能起到保护作用。线粒体融合蛋白2能够上调自噬相关分子Atg5、Beclin1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达，同时下调凋亡相关分子P62、Bax的表达，促进自噬/凋亡平衡向自噬方向发展，从而减轻慢加急性肝衰竭所致的肝损伤。因此，诱导自噬的发生有可能成为慢性乙型重型肝炎的治疗靶点。
七、改善微循环
肝脏是一个需氧器官，对缺血缺氧非常敏感。肝组织的大量坏死、活性氧(ROS)的产生过多、中性粒细胞的黏附以及内皮细胞的肿胀，导致肝脏灌注紊乱、缺血缺氧及缺血再灌注损伤，进一步加重肝损伤。与肝细胞相比，肝窦内皮细胞(LSECs)更加敏感且损伤时间更早。LSECs和肝细胞损伤导致凝血级联反应的激活和血小板减少。随后，凝血系统的紊乱进一步加重肝损伤。
1.蛋白酶激活的受体
蛋白酶激活的受体(protease-activated receptor，PAR)能够调节血小板和内皮细胞功能。内毒素激活PAR-1，进而激活中性粒细胞并促进肝实质细胞的损伤。与此同时，利用凝血酶受体激活肽激活PAR-1，能够加重内毒素诱导的肝损伤。干预PAR-4已被证实能够减少血小板和CD4+T淋巴细胞的招募，改善肝窦的灌注，并减弱肝细胞的凋亡与坏死，但是并不影响凝血系统及肝脏再生。
2.纤维蛋白原样蛋白2
纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2，fgl2)，又称 fgl2 凝血酶原酶，存在跨膜型和分泌型两种形式。跨膜型 fgl2主要表达于内皮细胞和巨噬细胞的表面，能够将凝血酶原切割成凝血酶，从而激活凝血途径。乙型重型肝炎患者及小鼠模型的肝组织中均观察到fgl2 诱导的微血管内纤维蛋白的沉积和血栓形成，表明 fgl2 参与了乙型重型肝炎的发生与发展。在鼠肝炎病毒3型(MHV-3)诱导的小鼠重型肝炎模型中，宁琴教授团队利用fgl2 反义质粒成功阻断fgl2的表达，减轻了炎性细胞的浸润、纤维蛋白的沉积以及肝细胞的坏死，从而提高了重型肝炎小鼠的生存率。
综上所述，本节依据乙型肝炎重症化和乙型重型肝炎(肝衰竭)分子病理机制的研究进展，从抑制肝细胞凋亡、控制炎症、促进肝细胞再生、调节细胞应激及改善微循环等多个角度探讨乙型肝炎重症化和乙型重型肝炎(肝衰竭)的治疗策略。上述治疗策略在动物模型中已证实了有效性，有些已在临床试验中进行了尝试，但是多数仍处于临床前阶段。将其实际应用于临床仍有许多问题待解决，如治疗靶点的选择、肝脏靶向性、载体的安全性以及药物的安全性和毒副作用等。
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