细菌形态学检查

一、细菌形态学检查

细菌大小0.2～20µm，无色半透明，不能用肉眼直接观察，可通过涂片（触片、抹片）后染色改变折射率，再通过显微镜对其形态和结构进行观察。

1.涂片（触片、抹片）的制作

（1）载玻片：选用通透、清洁、无油渍，具有良好附着性的载玻片。新买的载玻片需进行处理，滴上2～3 滴无水乙醇溶液擦拭干净，若载玻片上存在顽固油渍可在载玻片油渍处滴2 滴冰醋酸，用清洁纱布擦净后，在酒精灯外焰上轻拖数次。

（2）涂片（触片、抹片）：不同生物材料可采用不同的涂片（触片、抹片）方法。

① 体液（菌液）涂片：脑脊液、组织渗出液、乳汁等体液和细菌液体培养物，可直接用灭菌接种环挑取1～2 环材料，在载玻片上均匀涂抹成直径为1～1.5cm 大小的圆形或椭圆形涂膜，置于空气中自然干燥。菌液涂片流程详见图2-3-1。

② 组织脏器触片：用灭菌镊子夹住组织中部，用灭菌剪刀剪取小块组织，再用镊子夹出，以组织块的新鲜切面在载玻片上均匀压印或涂成薄层，干燥。触片流程详见图2-3-2。

③ 血液抹片：取5～7µl 血液于载玻片的一端约1cm 处，左手持含有血液的载玻片，右手持载玻片作为推片，将推片一端轻触血液并压在血液上，使血液呈“一”字形展开；将推片与载玻片形成30°～45°夹角，匀速将血液推向另一端，推成均匀的薄血膜，置于空气中自然干燥。血液抹片流程详见图2-3-3。

④ 非液体材料涂片：对于菌落、粪便和脓汁等材料，先用接种环取1～2 环无菌生理盐水放于载玻片上，然后将接种环在酒精灯外焰上灭菌，冷却后取少量菌落、粪便和脓汁等材料在载玻片上与生理盐水混匀，均匀涂抹成直径为1～1.5cm大小的圆形或椭圆形涂膜，干燥。

（3）干燥：涂片（触片、抹片）最好在室温中自然干燥。必要时，可将载玻片标本面向上，在远离酒精灯火焰上方烘干。

（4）固定：固定的目的一是使菌体蛋白凝固附着在载玻片上，防止染色时被冲掉；二是提高细菌对染料的通透性；三是杀死涂片中的部分微生物。但在制备高致病性病原菌特别是芽孢病原菌涂片和染色时，要严格处理染色用过的残液和涂片，以防病原扩散。常用的固定方法有火焰固定和化学固定。

① 火焰固定法：将已干燥的载玻片背面在酒精灯的外焰上来回移动，略作加热（以不烫手为度）进行固定（图2-3-4）。

② 化学固定法：血液、组织、脏器等作姬姆萨染色或单染色时采用甲醇固定。将已干燥的涂片浸入甲醇中2～3min，取出自然晾干；或在抹片上滴数滴甲醇，作用2～3min 后，自然挥发干燥。瑞氏染色时，染色液中的甲醇即可固定涂片。

2.染色

用染料对细菌进行染色，在毛细、渗透、吸附和吸收等物理作用，以及离子交换和酸碱等化学作用下，因细菌的结构和化学成分不同，使细菌着色而呈现不同的染色效果。常用的细菌染色方法主要有简单染色法和复染色法等类型。

（1）简单染色法：只用一种染料进行染色的方法，称为简单染色法。如亚甲蓝染色法，即在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的（足够覆盖涂抹点即可）亚甲蓝染色液，1～3min水洗后干燥（用吸水纸吸干或自然干燥，不能烘干），然后镜检细菌呈蓝色。

（2）复染色法：使用两种或两种以上染料或再加媒染剂进行染色的方法，称为复染色法，又称为鉴别染色法。主要包括革兰染色法、瑞氏染色法、姬姆萨染色法和抗酸性染色法等。染色时，有的将染料先后使用，有的混合同时使用。经过复染，不同的细菌或不同的构造呈现出不同颜色，显示出细菌的特殊结构及染色特性。

① 革兰染色法：革兰染色法是微生物学中最重要、使用最广泛的染色法。经革兰染色，革兰阳性菌被染成蓝紫色，革兰阴性菌被染成红色。革兰染色的主要步骤如下（图2-3-5）。

a.在固定好标本的玻片上，滴加草酸铵结晶紫染色液染色1～3min，水洗；

b.滴加革兰碘溶液于涂片上媒染1～3min，水洗；

c.滴加95%乙醇于涂片上脱色0.5～1min，水洗；(https://www.daowen.com)

d.加石炭酸复红或沙黄染色液复染0.5～1min，水洗；

e.自然干燥或吸干后镜检。

② 抗酸染色法：有些细菌的细胞壁含有大量脂质，且包裹着肽聚糖，较难着色，可通过加热和延长染色时间等方法使其染色。分枝杆菌的分枝菌酸与染料牢固结合后，难以被酸性脱色剂脱色，故而称为抗酸染色。而齐-尼氏抗酸染色法是利用加热使分枝菌酸与石炭酸复红结合成牢固的复合物，很难脱色，再经碱性美兰复染，使分枝杆菌仍呈现红色，而其他细菌和杂物呈现蓝色。抗酸染色的主要步骤如下。

a.在固定好标本的玻片上滴加石炭酸复红染色液，酒精灯外焰轻轻加热玻片背面约3min，以发生蒸汽为度（不能煮沸），水洗；

b.用3%盐酸酒精脱色，洗脱红色，水洗；

c.滴加碱性美兰染色液复染1min，水洗；

d.吸干，镜检。

③ 姬姆萨染色法：其主要步骤如下。

a.涂片用甲醇固定、干燥后，将涂片浸入染色缸中或滴加足量的染色液，30min、1 ～24h 后，取出水洗；

b.烘干、晾干或吸干，镜检。细菌染为蓝青色，组织和细胞等其他物质染为其他颜色。

3.光学显微镜和电子显微镜

（1）光学显微镜：普通光学显微镜以可见光（自然光或灯光）为光源，波长0.4～0.7µm。细菌经显微镜物镜和目镜共同作用放大1 000 倍后，达到或超过0.2µm 的人眼可见极限，即可用肉眼观察。常用的光学显微镜有明视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜等，分别适用观察不同状态的细菌形态或结构。

① 明视野显微镜：明视野显微镜是最常用的显微镜，一般称为普通光学显微镜。细菌经过涂片染色，增加了反差，使用明视野显微镜可取得良好的观察效果。

② 暗视野显微镜：暗视野显微镜也叫超显微镜，其聚光镜中央有挡光片，光线不能直射入物镜，而被标本反射和衍射的光线能进入物镜，因此视野背景呈现黑色，物体的边缘光亮。利用暗视野显微镜能见到4～200nm 的微粒子，分辨率比明视野显微镜高50 倍，常用来观察未染色的透明样品，如苍白螺旋体等。

③ 相差显微镜：相差显微镜用环状光阑代替可变光阑、用带相板的物镜代替普通物镜，带有合轴用的望远镜。它利用光的衍射和干涉现象，通过改变光线通过细胞各部细微结构的折射率和厚度不同而产生的相位差（x 相位差），将相位差变为振幅差，常用于观察活细胞和未染色的生物标本。

（2）电子显微镜：电子显微镜简称电镜，是利用电子流代替可见光、电磁圈代替放大透镜的放大装置。电子流波长约0.005µm，分辨率可达0.2nm、比普通光学显微镜提高1 000倍。电子显微镜按其结构和用途可分为透射电镜、扫描电镜、反射电镜和发射电镜等。生物学上常用透射电镜和扫描电镜。

① 透射电镜：透射电镜利用电子束穿透样品，获得样本的投影后再放大成像。可放大104～105 倍，分辨率达0.1～0.2nm。但电子容易散射或被物体吸收，穿透力较低，因此待检样品需制备成厚度仅为50～100nm 的超薄切片。

② 扫描电镜：扫描电镜的电子束不穿过样品，电子束聚焦在样本局部逐行扫描样本，入射的电子使样本表面被激发次级电子，被闪烁晶体接收后放大成像，能反映样品的表面结构和样貌。