三、分子鉴定技术
细菌鉴定主要有表型鉴定和基因型鉴定。表型鉴定是一种传统的细菌鉴定方法，由于许多种属之间的细菌在生理生化方面的特征相似，表型鉴定的方法已无法对其进行区分。随着分子生物学研究的不断深入，细菌分类鉴定也演变到了基因型鉴定水平，即通过对细菌DNA 的鉴定来达到区分种属的目的，鉴定结果更加可靠。目前，细菌分子鉴定技术有很多，包括聚合酶链反应技术、实时荧光定量PCR、多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳、质谱鉴定技术、液相芯片、变性高效液相色谱、指纹图谱等。(https://www.daowen.com)
1.聚合酶链反应（PCR）技术
PCR 以拟扩增的DNA 分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA 合成。该项技术是根据细菌的某个或数个有鉴定意义的目的基因片段扩增测序结果快速鉴定待检菌，通常只有纯培养的细菌才能进行鉴定。
其操作步骤主要有DNA 提取、PCR 扩增、产物鉴定。细菌DNA 提取方法有多种，常用为煮沸法。挑取2～3 个纯培养的细菌菌落，加入50～100µl 灭菌蒸馏水中，混匀，100℃煮沸10min，12 000 转/min 离心5min，留取上清液作为DNA 模板，-20℃保存备用。
PCR 反应体系常用25µl：上下游引物各1µl，模板DNA 2µl，Premix 12.5µl，灭菌蒸馏水8.5µl。PCR 反应的温度和时间参数因不同细菌而不同，反应过程：预变性；变性-退火-延伸；30～35 个循环；延伸。PCR 产物鉴定一般用1%琼脂糖电泳，利用凝胶成像系统观察结果。
2.实时荧光定量PCR（real-time PCR）
实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量。由于在PCR 扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA 序列进行定量分析。
实时荧光定量PCR 比PCR 灵敏度高且快速、便捷、安全，目前已有很多商品化的试剂盒广泛应用于微生物的鉴定，是分子鉴定技术的主要方法。
3.多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）
多位点序列分型技术是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过PCR 扩增多个管家基因内部片段，测定其序列，分析菌株的变异。一般测定6～10 个管家基因内部400～600bp 的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱，即这株菌的序列型（sequence type，ST）。这样得到的每个ST 均代表一组单独的核苷酸序列信息。多位点序列分型技术和脉冲场凝胶电泳两者在分辨率、重复性等方面的比较见表2-3-1。
表2-3-1 MLST 和PFGE 的比较
多位点序列分型方法的操作步骤如下。
（1）MLST 方案的设计
① 选择经过初步筛选的菌株：根据已有的分型方法和流行病学资料，选择约100 株具有代表性的不同亚型的菌株作为分析对象。
② 管家基因的确定：选择具有独特特征的基因位点，一般选择7 个位点进行后续试验和分析。
③ 引物的设计：一般选择目的片段长度为400～600bp，所有引物调整为同一退火温度，以适用于大范围流行病学监测和群体研究。在实际运用中，对于已有成熟MLST 方案的细菌，可直接从MLST 数据库中获取方案。
（2）核酸序列信息的获取：收集病原微生物标本；基因组DNA 的获取；PCR 扩增目的基因片段；目的片段的核酸序列测定；整合核酸序列信息。
（3）结果分析：以等位基因编号和ST 编号为基本分析单位，提交到MLST 分析网络服务器START 和eBURST；上传到GenBank 比对服务器进行BLAST 比对验证，直接分析核苷酸序列。
4.脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）
脉冲场凝胶电泳是用来分离大分子链DNA 片段的一种方法，通过脉冲场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。将细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb 到10Mb 的DNA 分子，主要用于基因组DNA的分离、流行病学分析、DNA 文库的构建、细菌分型等方面。其操作步骤包括：脉冲场凝胶电泳的DNA 样品的制备、限制酶消化、应用PFGE 对样品DNA 进行分析、分离和纯化大的DNA 片段。PFGE 具体操作步骤见图2-3-8。
图2-3-8 PFGE 操作步骤
（1）操作时的注意事项
① 换缓冲液时不要碰坏琼脂凝胶。
② 苯甲基磺酰氟（PMSF）操作时应在通风橱中进行，防止有毒物质挥发而造成身体伤害。
③ 用蛋白酶K 包埋材料时，可视情况而设定50℃温育时间。因长时间（24～48h）、50℃的温育可能造成高分子质量DNA 降解。
④ 琼脂糖凝胶块在TE（pH7.6）中4℃可存放数年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更长时间。
⑤ 一些高压电源带有保护电路，可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭，因此不适合脉冲场凝胶电泳。
⑥ 为保证脉冲场凝胶电泳保持14℃温度，需要一些冷却设备。一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷凝结成冰块而堵塞管道。
⑦ 电泳结束后，应及时取出凝胶进行染色等操作，以避免因时间太长而造成条带的弥散。
（2）脉冲场凝胶电泳的缺点：操作比较繁琐、耗时，一次电泳至少需要2 天时间；电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技术水平；不能同时优化胶的每个部分的条带分布；不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA 片段；一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化；PFGE 分型技术在细菌分子生物学分型中得到了广泛的应用，但有些菌种如广泛基因重组现象的细菌用PFGE 并不是一个适宜的分子分型工具。PFGE 电泳图谱见图2-3-9。
图2-3-9 沙门菌PFGE 电泳图谱
5.质谱鉴定技术
微生物蛋白质谱鉴定技术是将微生物样本与等量的基质溶液混合或分别点加在样品靶盘上，溶剂挥发后形成样本与基质的共结晶；利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质从激光中吸收能量使样本吸附，基质与样本之间发生电荷转移使得样本分子电离；样本离子在加速电场下获得相同的动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间质谱分析器进行质量分析，以检测到的离子峰为纵坐标、离子质荷比（m/z）为横坐标形成质量图谱，通过软件分析比较，筛选并确定出特异性指纹图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定（图2-3-10）。将蛋白质化合物电离后，检测带电蛋白质分子的质荷比。这种分子“指纹图谱”技术可以用于对纯培养的菌落进行快速菌种鉴定。
图2-3-10 VITEK MS RUO 操作步骤
与传统的表型鉴定及分子生物学鉴定技术相比，质谱鉴定技术在速度上具有明显的优势，一般鉴定1 个样品最快可在1min 完成；此外还具备检测准确、通量大、成本低廉的优点。许多研究表明，MALDI-TOF MS 敏感性很高，可以区分表型相似甚至相同的菌株，提供属、种、型水平的鉴定。
6.液相芯片
液相芯片是一种基于xMAP（flexible multi analyte profiling）技术的新型生物芯片技术平台，它在不同荧光编码的微球上进行酶、底物、抗原、抗体、配体、受体的结合反应或者核酸的杂交反应，并通过红、绿两束激光分别检测微球的编码和报告荧光来达到定性和定量的目的（图2-3-11）。该技术是一种非常灵活的多元分析平台，已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具。研究者可使用商品化试剂盒进行分析，也可以根据研究需要自行制备探针交联微球，建立反应体系。因此，该技术可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等众多领域的研究，是最早通过美国食品与药物管理局（FDA）认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。
图2-3-11 液相芯片技术检测基本原理示意
7.变性高效液相色谱
变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC）主要利用离子配对逆向层析的原理来分析核酸之间的差异。带正电荷的离子配对试剂TEAA 可以与带负电荷的DNA 磷酸基团在核酸非变性的条件下结合配对，并且TEAA 的疏水基团可以吸附在固定相分离柱上。DNA 分子越长，结合的TEAA 越多，与固定相结合也就越牢固、越不易被洗脱。当双链DNA 存在发生错配的异源杂合双链DNA 时，其解链温度存在差异。当柱箱温度升高时，异源双链DNA 由于错配区的存在更容易变性，因此将先于同源双链DNA被洗脱出来，而色谱图中将表现出双峰或者多峰的洗脱曲线。目前被广泛应用于微生物检测、点突变筛选和耐药性研究领域，成为一种新型、简单、快速的核酸分析方法。
8.指纹图谱
RiboPrinter® System 全自动微生物基因指纹鉴定系统通过功能强大的基于DNA 的数据库信息，可在8h 之内自动给出任何细菌株的基因指纹图谱，能够快速、准确、清晰地鉴定细菌，并在菌株水平上进行有效的、可重复的比对鉴定。
RiboPrinter® System 可鉴定和鉴别环境分离物、致病菌、有害生物体、质控菌株、有益生物体，以及任何对制药、个人护理和食品安全工业重要的微生物。