血细胞的细胞化学染色
细胞化学染色（cytochemical stain）是血液病检验和诊断最基本、最常用的技术。它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应原理对细胞内的各种化学物质（酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）做定性、定位、半定量分析。
细胞化学染色的方法较多，主要介绍常用的过氧化物酶染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、糖原染色、酯酶染色及铁染色。
（一）过氧化物酶染色
1.检测原理 细胞内的过氧化物酶（peroxidase，POX）能分解试剂底物H2O2而释放出新生氧，后者氧化二氨基联苯胺，形成金黄色不溶性沉淀，定位于POX所在部位。联苯胺法：粒细胞和单核细胞中含有的POX能将底物H2O2分解，产生新生态氧，后者将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。联苯胺蓝与亚硝基铁氰化钠结合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞质内酶所在的部位。
2.结果 骨髓或血涂片经染色后，在油镜下观察，颗粒细小而稀疏为弱阳性，颗粒较粗分布较密集者为阳性反应，颗粒粗大密集为强阳性。胞质中无颜色反应为阴性。二氨基联苯胺法为金黄色颗粒，联苯胺法为蓝色颗粒。
（1）粒系分化差的原始粒细胞呈阴性，分化好的原始粒细胞及以下阶段细胞均呈阳性，并随着粒细胞成熟，其阳性程度逐渐增强，中幼粒和晚幼粒细胞阳性颗粒充满胞浆，少部分盖在细胞核上。嗜酸性粒细胞阳性，嗜碱性粒细胞阴性或弱阳性。
（2）单核系细胞多数阴性，少数弱阳性，阳性反应物颗粒细小，散在分布于细胞浆与细胞核上。
（3）网状细胞、吞噬细胞可阳性。
（4）淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞、有核红细胞、组织细胞均阴性。
（5）遗传性过氧化物酶缺乏症，除嗜酸性粒细胞不受影响外，中性粒细胞与单核细胞POX缺乏或减低。
3.方法学评价 POX染色是急性白血病形态学分型中首选、最重要的细胞化学染色。由于试剂、染色等原因，会造成假阳性或假阴性。POX染色测定MPO的敏感性低于流式细胞术对MPO的测定。ICSH推荐二氨基联苯胺法。
4.临床意义 POX染色是辅助判断急性白血病类型的首选细胞化学染色，临床上主要用于急性白血病类型的鉴别。
（1）急性粒细胞白血病原始粒细胞POX染色呈局灶分布的阳性反应或阴性。
（2）急性早幼粒细胞白血病颗粒增多的异常早幼粒细胞POX染色呈强阳性反应。
（3）急性单核细胞白血病原始、幼稚单核细胞POX染色多呈细小颗粒弱阳性或阴性。
（4）急性淋巴细胞白血病原始、幼稚淋巴细胞POX染色均呈阴性反应。
POX染色对急性髓系细胞白血病（AML）与急性淋巴细胞白血病（ALL）的鉴别最有价值。
（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色
1.检测原理 中性粒细胞碱性磷酸酶（neutrophilic alkaline phosphatase，NAP）染色的方法有偶氮偶联法和钙-钴法两种。前者的染色原理是血细胞内碱性磷酸酶在pH为9.4～9.6的条件下，将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚，与重氮盐偶联形成灰黑色沉淀，定位于细胞质内酶活性所在之处。钙-钴法染色是碱性磷酸酶在碱性条件下将基质液中的β-甘油磷酸钠水解，产生磷酸钠，磷酸钠依次与硝酸钙、硝酸钴、硫化铵发生反应，形成不溶性棕黑色的硫化钴，定位于酶活性之处。
2.结果 NAP主要存在于成熟阶段的中性粒细胞（杆状核粒细胞及分叶核粒细胞）胞质内，其他血细胞基本呈阴性反应。
血涂片染色后，在油镜下观察，阳性反应为胞质中出现灰色到棕黑色颗粒，反应强度分为“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”五级。反应结果以阳性反应细胞百分率和积分值来表示。在油镜下，观察100个成熟中性粒细胞，阳性反应细胞所占百分率即为阳性率；对所有阳性反应细胞逐个按反应强度分级，将各级所占的百分率乘以级数，然后相加，即为积分值。
3.参考区间 积分为35～120（偶氮偶联法）。由于各个实验室的参考值差异较大，故应建立本实验室参考值。
4.方法学评价 因为钙-钴法操作比较烦琐且操作时间长，而偶氮偶联法的试剂盒操作简便，染色时间短，故目前国内常用偶氮偶联法。由于实验结果受影响的因素较多，如试剂、生理波动性及不同检验人员判断标准等，使结果相差较大，各实验室应建立本室参考范围。
5.临床意义
（1）NAP活性可因年龄、性别、应激状态、月经周期、妊娠及分娩等因素有一定的生理性变化。
（2）在病理情况下，NAP活性的变化常有助于某些疾病的诊断和鉴别诊断。
①感染性疾病：急性化脓菌感染时NAP活性明显增高，病毒性感染或寄生虫、立克次体感染时NAP积分值一般正常或降低。该检测对鉴别细菌感染与其他感染有一定价值。
②慢性粒细胞白血病的NAP活性明显减低，积分值常为0，类白血病反应时NAP活性极度增高，故可作为与慢性粒细胞白血病鉴别的一个重要指标。
③急性粒细胞白血病时NAP积分值减低；急性淋巴细胞白血病时NAP积分值多增高；急性单核细胞白血病时NAP积分值一般正常或减低。
④再生障碍性贫血时NAP活性增高；阵发性睡眠性血红蛋白尿时NAP活性减低，可作为两者鉴别的参考。
⑤其他血液病：恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性疾病（如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化等）NAP活性可增高，恶性组织细胞病时NAP活性降低。真性红细胞增多症时NAP积分值增高，继发性红细胞增多症NAP积分正常或降低，这是两者的鉴别方法之一。
⑥腺垂体或肾上腺皮质功能亢进，应用肾上腺皮质激素、ACTH、雌激素等NAP积分值可增高。
（三）过碘酸-希夫反应
1.检测原理 过碘酸-希夫（periodic acid-Schiff reaction，PAS）染色，又称糖原染色。过碘酸（Periodic acid）能将细胞质内存在的糖原或多糖类物质（如黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（-CHOH-CHOH）氧化，转变为二醛基（-CHO-CHO），与希夫（Schiff）试剂中的无色品红结合，形成紫红色化合物，而沉积于胞质中糖原类物质所存在的部位。
2.结果 胞质中出现红色物质为阳性反应，阳性反应物可呈弥漫状、颗粒状或块状红色。
（1）粒系细胞中原始粒细胞为阴性反应，自早幼粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性反应，并随细胞的成熟，阳性反应程度渐增强。
（2）单核系细胞呈弱阳性反应。
（3）淋巴系细胞大多呈阴性反应，少数可呈阳性反应（阳性率小于20%）。
（4）幼红细胞和红细胞均呈阴性反应。
（5）巨核细胞和血小板均呈阳性反应，巨核细胞的阳性反应程度随细胞的发育成熟而增强，成熟巨核细胞多呈强阳性反应。
3.方法学评价 PAS染色在恶性红系疾病中常呈阳性，但有时也呈阴性，在大多数良性红系疾病中常呈阴性，但少数也可呈阳性；急性白血病的PAS染色结果不特异。PAS染色受试剂等因素影响，可出现假阴性或假阳性。
4.临床意义
（1）红血病或红白血病时幼红细胞呈强阳性反应，积分值明显增高，有助于与其他红细胞系统疾病的鉴别；严重缺铁性贫血、重型珠蛋白生成障碍性贫血及巨幼细胞贫血，部分病例的个别幼红细胞可呈阳性反应。(https://www.daowen.com)
（2）急性粒细胞白血病，原始粒细胞呈阴性反应或弱阳性反应，阳性反应物质呈细颗粒状或均匀淡红色；急性淋巴细胞白血病原始淋巴细胞和幼稚淋巴细胞常呈阳性反应，阳性反应物质呈粗颗粒状或块状；急性单核细胞白血病原始单核细胞大多为阳性反应，呈弥漫均匀红色或细颗粒状，有时在胞质边缘处颗粒较粗大。因此，PAS反应对三种急性白血病类型的鉴别有一定参考价值。
（3）其他巨核细胞PAS染色呈阳性反应，有助于识别不典型巨核细胞，如急性巨核细胞白血病（M7）和MDS中的小巨核细胞；Gaucher细胞PAS染色呈强阳性反应，有助于与Niemann-Pick细胞鉴别；腺癌细胞呈强阳性反应，骨髓转移时PAS染色有助于与白血病细胞鉴别。
（四）酯酶染色
不同血细胞中所含酯酶的成分不同，根据酯酶特异性高低分为特异性酯酶（specific esterase，SE）和非特异性酯酶（nonspecific esterase，NSE）。特异性酯酶指氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色，非特异性酿酶染色根据基质液pH值不同分为酸性非特异性酯酶染色（即α-醋酸萘酚酯酶染色）、碱性非特异性酯酶染色（α-丁酸萘酚酯酶染色）和中性非特异性酯酶染色（α-醋酸萘酚酯酶染色和醋酸AS-D萘酚酯酶染色）。本章介绍常用的酯酶染色方法。
1.氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色
（1）检测原理：细胞内氯乙酸AS-D萘酚酯酶（naphthol AS-D chloroacetate esterase，NAS-DCE）能将基质液中的氯乙酸AS-D萘酚水解，产生萘酚AS-D萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联，形成不溶性有色沉淀，定位于细胞质内酶所在部位。
（2）结果：本实验常用的重氮盐为固紫酱GBC，形成红色有色沉淀。胞质中出现红色沉淀为阳性反应。
①此酶主要存在于粒系细胞中，特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”。原始粒细胞为阴性反应或弱阳性反应，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均呈阳性反应，早幼粒细胞呈强阳性反应，酶活性随细胞的成熟而逐渐减弱。嗜酸性粒细胞呈阴性或弱阳性，嗜碱性粒细胞呈阳性。
②单核细胞可呈阴性或弱阳性反应。
③淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞、幼红细胞、血小板等均呈阴性反应，肥大细胞呈阳性。
（3）方法学评价：NAS-DCE是粒细胞的特异性酯酶，由于受试剂等因素影响，可出现假阴性或假阳性。
（4）临床意义：主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型。
①急性粒细胞白血病时原始粒细胞呈阳性或阴性。
②急性早幼粒细胞白血病时酶活性明显增强，异常早幼粒细胞呈强阳性反应。
③急性单核细胞白血病时原始单核细胞及幼稚单核细胞几乎均呈阴性反应，个别细胞弱阳性。
④急性粒-单核细胞白血病时，粒系白血病细胞呈阳性反应，单核系白血病细胞呈阴性反应。
⑤急性淋巴细胞白血病和急性巨核细胞白血病均呈阴性反应。
2.α-醋酸萘酚酯酶染色
（1）检测原理：α-醋酸萘酸酯酶（alpha-naphthol acetate esterase，α-NAE），又称NSE，细胞内的α-NAE在pH中性条件下，能将基质液中的α-醋酸萘酚水解，产生α-萘酚，再与基质液中重氮盐偶联，形成不溶性有色沉淀，定位于胞质内酶所在部位。
（2）结果：胞质中出现有色沉淀者为阳性反应，因所用的重氮盐不同而出现不同颜色。本实验常用的重氮盐为固蓝B，阳性反应的沉淀为灰黑色或棕黑色。
①此酶主要存在于单核系细胞中，故又称为“单核细胞酯酶”。原始单核细胞为阴性或弱阳性反应，幼稚单核细胞和单核细胞呈阳性，阳性反应能被氟化钠（NaF）抑制。
②粒系细胞一般为阴性或弱阳性反应，阳性反应不能被氟化钠抑制。
③淋巴细胞一般为阴性反应，少数弱阳性，有的T淋巴细胞可呈点状阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制。
④巨核细胞和血小板可呈阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；部分幼红细胞呈弱阳性，阳性反应不能被氟化钠抑制；浆细胞呈阴性。
⑤有核红细胞多为阴性，少数弱阳性。
（3）方法学评价：α-NAE染色是急性白血病形态学分型时常规的细胞化学染色。在急性单核细胞白血病时阳性较强，M3或M2b也呈强阳性。试剂质量等原因可导致假阴性或假阳性。
（4）临床意义：主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型
①急性单核细胞白血病时，白血病细胞呈强阳性反应，能被氟化钠抑制。
②急性粒细胞白血病时，呈阴性反应或弱阳性反应，但阳性反应不能被氟化钠抑制
③急性早幼粒细胞白血病时，异常早幼粒细胞呈强阳性反应，阳性反应不能被氟化钠抑制。
④急性粒-单核细胞白血病时，粒系白血病细胞呈阴性或阳性反应，但阳性反应不能被氟化钠抑制；单核系白血病细胞呈阳性反应且能被氟化钠抑制。
⑤急性淋巴细胞白血病和急性巨核细胞白血病时，白血病细胞可呈阴性或阳性反应，阳性反应不能被氟化钠抑制。
（五）铁染色
1.检测原理 骨髓中的含铁血黄素（细胞外铁）和中、晚幼红细胞胞质中的铁蛋白聚合物（细胞内铁）在酸性环境下，与亚铁氰化钾作用，经普鲁士蓝反应形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于细胞内外铁存在的部位。
2.结果 铁染色（iron stain，IS或ferric stain，FS）中的细胞外铁反映骨髓中铁的储存量，主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞内，细胞内铁反映骨髓中可利用铁的量，主要指存在于中、晚幼红细胞及红细胞内的铁。
细胞外铁：骨髓涂片染色后，观察骨髓小粒中贮存在单核-巨噬细胞系统内的铁，阳性反应呈蓝绿色弥散状、颗粒状、小珠状或块状。根据阳性程度分为“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”五级。
细胞内铁：正常幼红细胞（中、晚幼红细胞）的细胞核周围细小呈蓝色的铁颗粒，含有铁颗粒的幼红细胞称为铁粒幼细胞。在油镜下连续计数100个幼红细胞，计数含铁粒的幼红细胞数，即为铁粒幼细胞所占的百分率。如果含铁颗粒在5个以上，环绕细胞核排列超过核周1/3以上者，称为环形铁粒幼细胞。
3.参考区间 细胞外铁：+～++；细胞内铁：阳性率12%～44%。不同的实验室其细胞内铁的参考值相差较大，应建立本实验室的参考值。
4.方法学评价 铁染色是临床上应用最广泛的一种细胞化学染色，是反映机体铁储存的金标准，不受多种病理因素影响，但不如血浆铁蛋白敏感。有时存在假阳性和假阴性。
5.临床意义 用于缺铁性贫血和环形铁粒幼细胞贫血的诊断和鉴别诊断。
（1）缺铁性贫血：临床上将铁缺乏症分为三期，即存铁缺乏期、缺铁性红细胞生成期、缺铁性贫血期。其细胞外铁均为阴性，细胞内铁阳性细胞明显减少或消失。经铁剂治疗一段时间后，细胞内铁、外铁可增多。因此，铁染色是诊断缺铁性贫血和指导铁剂治疗的可靠的检查方法。
（2）铁粒幼细胞贫血及伴环形铁粒幼红细胞增多的难治性贫血，其环形铁粒幼细胞增多，占有核红细胞15%以上，细胞外铁也常增加。
（3）非缺铁性贫血如再生障碍性贫血、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血等，细胞外铁和细胞内铁正常或增加，而感染、肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、血色病等，细胞外铁明显增加而铁粒幼红细胞可减少。