五、尿液酶的检查
正常人每日排出的蛋白质成分中有少量的酶。由于绝大多数酶的分子较大，很难由肾小球滤过，滤过的某些小分子酶类大部分又被肾小管重吸收，因此尿液中酶的来源主要是肾小管上皮细胞，其次是血浆、尿路及生殖系统。其中，来自肾小管上皮细胞的酶主要有谷氨酰氨基转移酶、丙氨酸氨基转肽酶、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶等，一旦肾组织损伤，这些酶可分泌到尿液中。另外，血液中的淀粉酶、溶菌酶和胰蛋白酶在大量升高或肾小球通透性增加时也可进入尿液。早在1959年Rosolki等就观察到肾脏疾病患者尿液酶活性升高，并用于临床诊断。由于尿酶的测定方法简单、敏感，而且大多数项目已有成品试剂盒，使这些检查逐步在临床开展，用于诊断早期的肾损害及疗效观察。
在尿酶测定时，通常是计算单位体积尿（L或ml）中的酶活性单位，因受尿量影响，波动过大而无实用价值。收集24小时尿标本测定其酶活性再进行换算虽实用价值很大，但需时间长，且需妥善保存标本。Dorfman提出采用夜间8小时尿进行测定，方法标准、结果可靠。Well-wood等建议同时测定尿肌酐来计算酶活性/肌酐，以免酶活性因尿流速率变化而异。本法方便，可以测定随机尿，标本用量少，对肾病诊断价值较大。因此，尿酶活性可以下列三种方法进行计算：
①肌酐换算法
②8小时尿量计算法
尿酶活性（U/8h）=酶单位/L×8h尿量（L）
③酶清除率法
（一）N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-D-glucosaminidase，NAG）
测定N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶是一种位于细胞溶酶体的酸性磷酸酶，存在于所有组织中，以前列腺和肾近曲小管细胞内含量最高，分子量约为130～140kD，因分子量较大，正常肾小球不能滤过。尿液中NAG主要来源于肾近曲小管上皮细胞，故尿NAG可作为肾小管损伤的标志物。肾组织中有多种NAG同工酶，以A型、B型、I1型、I2型为主，肾损伤时B型明显升高。NAG可水解底物对硝基酚-N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷（PNP-NAG）或2-氯-4硝基苯基-N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷（CNP-NAG），使之生成NAG及PNP或CNP。该酶化学性质稳定，不受尿液中细菌及细胞成分的破坏，体外冷冻（或冷藏）数日活性不变。
1.检测原理
（1）对硝基酚比色法：NAG催化对硝基酚-N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷（PNPNAG）水解，生成对硝基苯酚（PNP），经一定时间后终止反应，并使PNP显色，在规定波长下检测PNP引起的吸光度升高值，推算样品中NAG的活性。在尿NAG测定的同时，测尿肌酐浓度，计算NAG/Cr可排除由于尿液稀释或浓缩带来的影响。
（2）荧光光度法：NAG可水解荧光底物4-甲基伞形酮N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷，生成游离的4-甲基伞形酮（4-MU），后者在碱性条件下变构，受激发后产生荧光可用于仪器检测。
（3）电泳法：基于蛋白电泳分离的原理，尿液蛋白在载体上经过电泳，可分离出NAG同工酶。
2.方法学评价（表2-27）。
表2-27 N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶测定的方法学评价
3.参考区间
PNP-NAG法：尿NAG活性＜18.5U/L尿；
肌酐校正后：＜1.4U/mmolCr（＜16.1U/gCr）；
荧光光度法：3.19～6.39U/gCr。
4.质量保证
（1）标本采集：根据检查目的选择留尿方法：如直接测定并报告酶活性，最好采用晨尿；若计算酶/Cr可用随机尿。但无论哪种标本，在采集前均禁做一切泌尿、生殖系统的有创性检查，并避免生殖道分泌物污染。
（2）标本处理：应及时测定，否则需离心除去有形杂质，取上清液冷冻或冷藏。血尿、脓尿等病理性尿液应离心后取上清液检测。
（3）试剂处理：用对硝基酚比色时，配制底物溶液宜在室温下以少量试剂缓冲液（pH4.6）将底物调成糊状，再逐渐加缓冲液到所需量。也可用磁力搅拌器助溶，切勿污染、加热。
（4）线性范围：如酶活性偏高，吸光度值超出线性范围（721型分光光度计＞0.6；722以上型＞1.0），应将标本以生理盐水稀释后重新测定。
（5）影响因素：尿液肌酐浓度增高可使结果偏低，必要时应稀释尿液。
5.临床意义
（1）肾脏病变：尿NAG酶活性增高是肾小管损害的敏感指标，各种原因所致肾小管损伤均可出现，肾小球病变时尿NAG酶活性也增高，并与病变程度相关。因此在肾小球肾炎、肾盂肾炎、慢性肾功能不全、肾病综合征以及高血压、糖尿病、过敏性紫癜、多发性骨髓瘤等导致肾损害时，NAG活性都明显升高，以NAG-B最明显。
（2）肾移植排斥反应：肾移植存活者，尿NAG不增加。2/3的肾移植患者在发生排斥反应的前1～3天，NAG酶活性即可明显升高。该指标有利于早期发现排斥反应。
（3）上、下尿路感染的鉴别：上尿路感染如肾盂肾炎时NAG酶活性升高；下尿路感染如膀胱炎、尿道炎时，酶活性无明显升高。上尿路感染时的测定结果高于下尿路感染，有助于感染的定位检查。
（4）糖尿病肾病、高血压肾病：近年来的研究发现糖尿病、高血压患者出现肾病的早期即可有肾小管损伤，尿NAG、α1-MG等肾小管损伤标志物的变化甚至早于微量白蛋白尿的出现，三者的联合检查对早期发现糖尿病、原发性高血压、妊娠诱发高血压并发肾病有一定意义。
（二）尿液γ-谷氨酰基转移酶（γ-glutamyl transferanse，γ-GT或GGT）
测定肾、肠及胆道等组织均含有此酶，尿液中浓度为血清中浓度的26倍，活性稳定，冷冻或冷藏可保存数日。人体内共有4种同工酶，当肾小管上皮细胞受损时γ-GT释放入尿液中使测定值升高。
1.检测原理
（1）对硝基苯胺比色法：γ-GT可将γ-L-谷氨酰基对硝基苯胺的谷氨酰基转移到受体双甘肽分子上，生成谷氨酰基双甘肽，同时生成有色的对硝基苯胺，在410nm波长比色测定生成的对硝基苯胺量。
（2）速率法：以溶解度较大的L-γ-谷氨酰-3羧基-对硝基苯胺（3-carboxy-GGPNA）做底物，γ-GT将其谷氨酰基转移给双甘肽，同时生成黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，引起405～410nm波长处吸光度的增高。吸光度增高的速率与酶活性呈正比。
（3）重氮反应比色法：以L-谷氨酰-α-萘胺作底物，γ-GT将其谷氨酰基转移给双甘肽，同时释放出游离的萘胺，后者与重氮试剂反应，产生红色化合物。
2.方法学评价（表2-28）。
表2-28 尿液γ-谷氨酰基转移酶测定的方法学评价
3.参考区间
对硝基苯胺比色法：37℃4～42U/L或6～45U/gCr；
速率法：＜30U/L或3～3.7U/mmolCr（或＜18～37U/gCr）。
4.质量保证
（1）标本要求：新鲜晨尿，为避免由于尿流速率带来的结果偏差，对明显浓缩或稀释尿建议测Cr。尿液与试剂1∶20为最适范围。
（2）仪器校准：在波长405～410nm处，底物γ-L-谷氨酰-3羧基-对硝基苯胺的吸光度最低，而对硝基苯胺仍保持一定的吸光度，两者差值最大。因此分光光度计的波长应力求准确并固定使用，定期测定校准仪器的吸光系数。
（3）底物与试剂：务必保持底物的纯度，否则γ-L-谷氨酰基对硝基苯胺可能含有D-构型，将抑制γ-GT的活性。试剂中游离的对硝基苯胺和其他不纯物质对酶活性有抑制作用。如试剂空白过高，表示该试剂已不能使用。双甘肽在高温条件下保存会部分水解产生游离甘氨酸，后者也可抑制酶活性，因此各种试剂均应低温保存。
5.临床意义
（1）肾脏受损的早期诊断：尿γ-GT是肾小管炎症的敏感指标，当肾脏局部的炎症累及近曲小管时，尿γ-GT增高，以自身免疫所引起的炎症反应（如SLE）最为显著，某些重金属所引起的中毒性肾损害，尿γ-GT也显著增高。相反，如果肾脏仅有组织结构上的异常或继发性损害，并无炎症反应（如多囊肾、糖尿病肾病等），尿γ-GT并不增高。此外，同其他尿酶一样，尿γ-GT也可作为氨基糖苷类抗生素肾毒性的监测指标。注射造影剂可使尿γ-GT的排出暂时性增高。
（2）肾小管肾炎的疗效观察：大多数肾小管肾炎患者尿γ-GT均增高，尿γ-GT增高的程度与肾炎的活动度直接相关。当肾炎患者用皮质激素或免疫抑制剂治疗得以缓解时，尿γ-GT大多可恢复正常。
（3）肾癌的标志物：肾癌患者肾组织γ-GT的含量显著低于正常组织，尿γ-GT也低于正常。
（4）肾移植排斥反应观察指标：肾移植后，随着肾功能的恢复，尿γ-GT的排出亦明显增高，1周左右尿γ-GT恢复正常水平。如果出现排斥反应，尿γ-GT将再一次升高。
（三）尿液丙氨酸氨基肽酶测定
丙氨酸氨基肽酶（alamine aminopeptidase，AAP）依据其组织来源，AAP同工酶分为血清、肝、肾、尿四种。因分子量大，血中AAP不能通过肾小球滤过膜。尿AAP主要来源于肾小球小管刷状缘，是肾脏损害较灵敏和特异的指标。
1.检测原理 尿液中AAP测定多用丙氨酸对硝基苯胺基质法（速率法），在405nm波长处测定对硝基苯胺的生成率。(https://www.daowen.com)
2.方法学评价 本法试剂已商品化。
3.参考区间 ＜1.8U/mmolCr（或＜16U/gCr）。
4.临床意义
（1）各种肾脏疾病诊断的辅助指标：肾病综合征、慢性肾小球肾炎及慢性肾功能不全时，尿AAP均有明显升高。
（2）肾移植后排斥反应的观察：肾移植后发生排斥反应者，89%的患者尿NAG活性升高，91%的尿AAP活性升高，升高时间早于临床表现。
（3）肾毒性损害的早期指标：在金属如汞所致急性肾中毒，庆大霉素、顺铂、环孢素A等所致药源性肾损害中发现，尿AAP、NAG升高早于临床表现，尿AAP特异性类似于尿NAG，但敏感性高于NAG。
（四）尿淀粉酶测定
淀粉酶（amylase，AMS）全称1，4-α-D-葡萄糖-葡聚糖水解酶，能水解淀粉、糊精和糖原，对食物中多糖类化合物的消化起重要作用。当胰腺有炎症或胰液排出受阻时，胰腺的淀粉酶会从胰管管壁及胰泡逸出，吸收入血而随尿排出。
1.检测原理
（1）碘-淀粉比色法（Somoggi法）：用已知浓度的可溶性淀粉为底物，经过标本中淀粉酶水解作用后，剩余的淀粉与碘作用产生蓝色，测定酶作用后剩余的淀粉量来推算出酶活性。
（2）染色法：将某些色素与淀粉结合作为基质，在淀粉酶作用下释放可溶性色素，再根据释放出的色素量来推算尿淀粉酶活性。
（3）对硝基苯酚麦芽七糖法（4NP-7G法）：以对硝基苯酚麦芽七糖苷为底物，经α-淀粉酶催化，生成一系列寡糖，最终生成对硝基苯酚和葡萄糖。
（4）电泳法：基于蛋白电泳分离的原理，尿液蛋白在载体上经电泳分离。
（5）酶法：利用CNPG3，这种底物直接与α淀粉酶发生反应，从底物中释放出CNP，每分钟吸光度增加与α淀粉酶的活性呈正比，吸光度增加在波长处410nm测定。
（6）干片（速率法）：将一滴患者样本滴在干片上，并通过扩散层均匀地分布到试剂层，扩散层含有反应所需的染色淀粉底物，样本中的淀粉酶催化该已染色淀粉的水解反应，生成更小的染色糖类。然后，这些染色糖类分散到试剂下层。分别在2、3分钟和5分钟时，通过反射光光度法测定试剂层中已染色糖类的反射强度。两次干片反射强度读数的差与样本中的淀粉酶活性呈正比。
2.方法学评价（表2-29）。
表2-29 尿淀粉酶测定的方法学评价
3.参考区间
（1）AMS总活性
①Somoggi法（100ml血清中的AMS，37℃15分钟水解5mg淀粉为1U），AMS为800～1800U/L；尿液AMS为1000～12000U/L。
②2-氯-4硝基苯酚-α-麦芽糖三糖法（CNP-G3法，37℃），血清AMS＜60U/L；尿液AMS＜300U/L。
③4NP-7G法（37℃和其他规定条件下1分钟水解1μmol对硝基苯酚麦芽七糖苷为1U），血清100～220U/L；尿液120～1200U/L。
（2）AMS同工酶：免疫抑制法。
血清P型为30%～55%；S型为45%～70%；
尿液P型为50%～80%；S型为20%～50%。
（3）酶法42～321U/L。
（4）干片（速率法）：32～641U/L。
4.质量保证
（1）标本处理：及时检验同时测定尿肌酐，计算其比值能真实反映尿淀粉酶的含量。不能及时检测时，应将尿液pH调整在7.0左右，防止淀粉酶失活。
（2）碘-淀粉法：尽量使用同一批号的淀粉产品配制底物，以保证日间检查结果的稳定性与可比性。更换淀粉批号时应重新进行评价。本法的线性范围在酶活性400U/L以下，当测定管吸光度值小于空白管吸光度值的一半时，说明底物浓度不够，应将标本加大稀释倍数后测定。
（3）CNP-G3法：氯化物、草酸盐、柠檬酸盐及EDTA盐等抑制淀粉酶活性，因此进行血淀粉酶测定时应避免使用上述物质做抗凝剂，最好采用血清或肝素抗凝血浆。
（4）4NP-7G法：△A/min超过0.15时，应用生理盐水将标本稀释10倍后重新测定。
（5）酶法：未稀释试剂处理后用水冲洗废液管道，以防止叠氮化合物在管道内的积累。
（6）干片（速率法）：分析前，轻轻颠倒混匀样本，并使其平衡至18～28℃。
5.临床意义
（1）急性胰腺炎：发病3～6小时，血清AMS活性开始增高，20～30小时达峰值，持续3天～5天恢复正常；发病12～24小时，尿AMS开始升高，3～10天后恢复正常。血清AMS同工酶P型升高。血和尿液中AMS不一定成平行关系，血AMS上升为一过性，尿AMS出现较早，持续时间较长。AMS活性增加不能反映疾病的严重程度，胰腺广泛破坏时的AMS浓度不一定显著增加。血清AMS主要用于急性胰腺炎的早期诊断，尿AMS主要用于病情观察。
（2）慢性胰腺炎：稳定期，血清和尿AMS一般不增高，急性发作时AMS及其P型同工酶均升高。连续监测1周尿AMS，有2次以上升高者视为异常。
（3）胰腺其他疾病：任何原因导致胰腺管阻塞，如胰腺癌、胰腺囊肿、肠梗阻、胆石症等AMS活性均可增高。流行性腮腺炎时AMS也升高，但以S型为主。
（4）肝脏疾病：正常人血清AMS主要由肝脏产生，故血清中和尿液中AMS同时减低见于肝病。
（五）溶菌酶的测定
溶菌酶（lysozyme，LZM）因能溶解细菌的胞壁，故又名胞壁酶，是正常机体防御机制的组成部分。溶菌酶因分子量较低，可通过肾小球基底膜滤出，90%以上在肾小管重吸收。尿液中溶菌酶超过3mg/L时，称为溶菌酶尿。
1.检测原理
（1）琼脂扩散平皿法：含菌（1mg/ml）琼脂（2mm）平板中打孔，加入被测尿标本。经4℃18小时扩散后，尿标本中溶菌酶溶解孔周围的细菌使琼脂出现溶菌环，溶菌环直径与溶菌酶含量的对数呈直线关系。经与溶菌酶标准液比较，计算被测标本中溶菌酶含量。
（2）光电比浊法：将待测尿标本加入细菌悬液，经过一定时间后比浊，浊度与尿标本中溶菌酶含量呈反比，即尿标本中溶菌酶含量越多，被溶解细菌越多，被测液浊度下降越明显。
（3）ELISA双抗体夹心法：固相结合抗溶菌酶抗体，与被测尿标本中溶菌酶结合，加入酶标记抗溶菌酶，加底物显色，色泽深浅与溶菌酶的含量呈正相关。
2.方法学评价 见表2-30。
表2-30 尿液溶菌酶测定的方法学评价
3.参考区间 0～2mg/L。
4.临床意义
（1）鉴别肾小管病变：炎症、中毒所致的肾小管损害，低分子量蛋白质重吸收减少，导致尿溶菌酶含量升高。
（2）判断肾小管病变预后：急性肾小管坏死时尿液溶菌酶含量及持续时间反映坏死的程度及预后。慢性肾功能不全时，尿液溶菌酶升高则预后差。
（3）判断白血病类型、疗效、预后：急性单核细胞白血病血清溶菌酶含量增高导致尿溶菌酶含量增高，急性淋巴细胞白血病血清溶菌酶及尿液溶菌酶均正常。白血病患者溶菌酶降低、升高与疾病缓解、复发有一定关系。
（4）检测和监控肾移植排斥反应：同种异体肾移植后，尿液中溶菌酶排出量升高是肾移植排斥反应的标志。
（5）其他疾病：如大面积烧伤患者，尿溶菌酶水平与大面积烧伤并发感染的严重程度密切相关，是观察病程发展和判断预后的及时客观可靠的指标。