常用体外精液处理技术
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体外精液处理技术就是通过人工方法对精液进行处理,去除精浆及其所含的有害物质,选择形态正常、活力强的精子,并使精子在体外获能。目前,体外精液处理已成为各项辅助生殖技术治疗中的常规步骤。选择精液处理方法时,不仅要考虑精液的质量问题,还要考虑处理过程可能对精液产生的影响。如去除精浆的同时会造成精子的氧化应激损伤,增加DNA断裂率。
(一)体外精液处理技术的基本要求
①操作简易、快捷,费用低;②能够获得较多活动精子;③不对精子造成损伤或对分离出的精子产生非生理性改变;④尽可能去除死精子和其他细胞,包括白细胞和可能的细菌;⑤去除有毒的或其他生物活性物质,如活性氧(ROS)类物质;⑥同时能够处理较多体积的精液。
(二)常用优选精子的体外精液处理技术
1.上游法
本方法主要利用活动精子的游动能力,即能游过液体界面进入不同的培养液,从而与死精子、活动力差的精子、凝集精子、畸形精子、体细胞及其他有害成分和杂质分离。通过物理作用而使精子重新分布,理论上不影响精子的生物学特性。但因为依赖于活动精子的运动能力,所以主要用于质量较好或相对正常的精液。该方法的不足是运动精子回收率低,而回收精子的数量与体外受精率及妊娠率有很大关系。回收率依赖于精子细胞团表面积和精子活力。由于细胞团有多层细胞,有潜在运动能力的精子可能处在细胞团内部,不能到达与培养基接触的界面;而且,细胞团内精子彼此紧密接触,及精子与细胞碎片或白细胞紧密接触,后者产生高水平ROS,可导致精子质膜发生脂质过氧化反应,降低精子功能。技术方面的缺陷促使更温和的精子分离技术发展,如为克服离心沉淀使ROS增多,可直接使液化的精子上游(直接上游法);为提高回收率,也可采用少量多管直接上游,以增加精液与培养基的接触面积。目前主张对精液正常者应用上游法,而对精液严重异常者使用密度梯度离心法能取得更好的效果。
2.密度梯度离心法
可用于质量相对较差的精液。在ART中,Percoll是较早应用的梯度介质。由于可能存在内毒素污染、胞膜改变和用Percoll污染的精子受精导致炎症反应的危险,目前Percoll主要用于实验研究,临床应用方面,已为IxaPrep、PureSperm和Isolate等产品所替代。与上游法相比,密度梯度离心法能回收更多的形态正常的精子,并明显增加精子的活力和体外生存能力。尤其在精液严重异常(少精子症、弱精子症及畸形精子症等)时,更能体现其较高回收率的优越性。在ART中,目前密度梯度离心法常与上游法结合使用,即先进行密度梯度离心法,对得到的精子沉淀再行上游法,以获取最佳质量的精子。
3.玻璃纤维过滤法
利用精子的自身运动和玻璃纤维的过滤作用,使活动精子与不动精子分离,可获得高比例的顶体完整的精子。且用该法处理的精子作用去透明带的金黄地鼠卵及结合人卵透明带的数目均高于Percoll处理的精子。在收集到的精液中,虽然损失了相当多的精子,特别是质量较差的精子,但几乎保留了所有活动精子。因此,显著提高了活动精子、前向活动精子及有完整功能性膜的精子的百分率,尤其对质量较差的精液分离效果较好,可除去大约90%的白细胞。这种方法可显著减少精液中的氧自由基,对保护精子功能极为重要。精液处理效果与选用的玻璃纤维种类、规格等直接相关。对精子的破坏及过滤过程中玻璃纤维破碎的潜在危险,则主要取决于所用玻璃纤维的种类和过滤时冲洗的强度。也有研究发现,虽然玻璃纤维过滤法对活动精子的回收率较好,但获得的精子的直线运动低于上游法获得的,可能与其引起精子的超微结构损害有关,因此该法在临床上应用少。
(三)特殊精液的处理
1.完全不动的精子(包括附睾精子、睾丸精子)
ICSI成功的关键是注射有生育力的精子,从完全不动的精液样本中筛选出活精子用于ICSI,反映了精液处理和改善精液功能的重要性。能运动的精子是活的,可通过精子的运动特性来区分。对于完全不动的精子,这种可区分的标志不再适用。因此,需要一种无害的方法从完全不动的精液中识别出适用于ICSI的活的精子,且这种方法不损害精子。目前有2种方法:①使用刺激物(己酮可可碱)激发精子活力,已成功用于区分活的睾丸精子和附睾精子,并有婴儿出生的记录。②通过低渗肿胀试验(hypo-osmotic swelling test,HOS)测试精子膜完整性是临床常用方法。目前该技术经简化改进,明显提高了受精率和妊娠率。另外,精子无存活或无活力可见于慢性前列腺炎,此时抗生素治疗可恢复精子活性;生殖道的运输延迟可使精子衰老,表现为无活力,此时增加射精次数可恢复精子活性。
2.逆行射精的精液
射精后从尿液中回收到一定数量的精子并恢复和保持其活力是成功妊娠的关键。由于精子生存的最佳环境是中性偏碱,而正常人的尿液呈弱酸性,因此收集精液前应碱化尿液。
3.冻融精液的优选处理
随着冷冻技术的不断成熟,越来越多的冷冻精液用于ART。由于冷冻精液的人工授精能预防性传播疾病,国内外已相继立法禁止使用新鲜精液人工授精,从而使冷冻精液成为供精人工授精的唯一选择。精液冷冻复苏后,精子活力和其他运动参数均比冷冻前有所降低,且精子处于渗透压高于自身的冷冻保护剂中。在去除冷冻保护剂的同时,最大限度地保护精子质量是面临的重大问题。Somfai等报道与上游法相比,Percoll梯度离心处理冻融牛精子,得到的精子具有较高的活力和完整的顶体。Rho等通过比较Percoll、上游法、玻璃纤维过滤法处理山羊冻融精液并用于体外受精,认为受精后12 h,Percoll处理的精液雄原核的形成率优于其他两组,其后的卵裂率、囊胚形成率和平均细胞数也均高于其他两组。