CAR结构优化

如前文中所介绍，CAR是人工设计的分子，主要由以下几个具有不同作用的部件组成（图16-4）：信号肽（SP）保证CAR能够定位到细胞表面；抗原识别区负责识别特异靶点并起始T细胞活化信号；跨膜区（TM）由胞外柔性片段与跨膜片段构成，负责将CAR固定在细胞膜上并将T细胞活化信号传递到胞内；胞内区主要由共刺激信号分子（CD28或41BB）与CD3ζ 片段构成，在接收活化信号后负责启动并维持T细胞增生与杀伤等。其中，抗原识别区与共刺激信号分子对CAR-T细胞的影响较大，也是CAR结构中最常改变的部分。

图16-4　CAR 主要组件示意图

目前，主要使用单链抗体（scFv）的可变区（VH和VL）作为CAR的抗原识别区。因此，scFv特异性在很大程度上决定了CAR-T细胞杀伤准确性，与治疗安全性和有效性紧密相关。在本研究中，我们使用的scFv均源于已经在临床试验中被证实安全的抗体。其中，CD276特异性scFv（CD276-scFv）源于抗体MGA271，该抗体在人体中被证实是安全的；HER2特异性scFv（HER2-scFv）源于FRP5，使用本序列的CAR-T细胞被证明是安全有效的。因而，本研究构建了基于这2种scFv的单靶点CAR-T细胞，并分析了这些CAR-T细胞的功能，初步结果证实，单靶点CAR-T细胞具备强大的抗原依赖性杀伤活性。在此基础上，利用G4 s连接序列将CD276-scFv与HER2-scFv连接起来，构建了双靶点CAR（图16-4）。为了防止scFv排列顺序影响CAR-T细胞功能，本研究构建了2种双靶点CAR-T细胞，以便观察scFv顺序对CAR-T细胞治疗的影响。前期结果显示，2种双靶点CAR-T细胞均能有效杀伤肿瘤细胞、效果没有明显差异，初步说明scFv排列顺序不影响CAR-T细胞活性，与之前报道一致。接下来，我们还将进一步研究scFv数量及排列顺序等对CAR-T细胞治疗的影响。(https://www.daowen.com)

共刺激信号分子提供T细胞活化的第二信号，影响了CAR-T细胞增生潜能及长期抗肿瘤活性（图16-5）。CD28与41BB是目前应用最广泛的共刺激信号分子。虽然含CD28或41BB共刺激分子的CAR-T细胞的短期杀伤效果差别不大，但是后者的长期杀伤活性更好，具备更好的肿瘤抑制能力。我们的前期结果也证实，2种共刺激信号分子不影响CAR-T细胞的短时杀伤，而含41BB共刺激分子的CAR-T细胞的长期杀伤效果更好。因此，本项目将重点研究以41BB作为共刺激分子的单靶点和双靶点CAR-T细胞抗肿瘤的活性。

图16-5　共刺激信号影响CAR-T 细胞分化与长期抗肿瘤活性