单靶点CAR-T细胞构建
首先构建慢病毒表达质粒。慢病毒骨架质粒（pSin-EF1-GFP）购自Addgene；相关抗体（scFv）序列及CAR序列根据文献报道由上海生工生物工程股份有限公司合成；相关引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。完整CAR序列合成后，利用重叠PCR通过2A序列将CAR序列与GFP连接，经酶切连接反应插入慢病毒表达质粒，转化感受态细胞并提取质粒，送上海生工生物工程股份有限公司测序验证。
待慢病毒构建成功后，利用293T细胞进行病毒包装。待293T细胞的融合度达到80%时，利用磷酸钙转染试剂将慢病毒表达质粒和包装质粒（psPAX2和pMD2.G）转染293T细胞。转染72 小时后，收集含病毒颗粒的上清，浓缩并测定病毒滴度后待用。
在准备慢病毒的同时，进行T细胞纯化和活化。利用磁分选系统纯化的CD8+ T细胞，加入CD3/CD28磁珠活化48小时，然后加入病毒上清进行离心感染，感染后加入含IL-2的新鲜T细胞培养基进行扩增，并在感染后72小时通过F（ab）2抗体标记与GFP表达检测CAR表达水平。根据细胞增生速度，每2～3天补充新鲜细胞因子和培养基，进行分瓶处理。
含CD28或41BB共刺激信号的单靶点CAR（靶向CD276或HER2）慢病毒表达质粒被成功构建（结构见图16-12）。经293T细胞转染后，成功获得能够表达这些CAR的慢病毒。利用慢病毒进行离心感染，成功获得了相应CAR-T细胞。慢病毒系统能够有效地将CAR序列整合进入人T细胞基因组，CAR+细胞比例超过59%（图16-13），而且在整个培养过程中（感染后3天～21天）该群细胞比例稳定（结果未展示）。获得CAR表达后，基因修饰T细胞增生较普通T细胞要快。
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图16-12 含不同共刺激信号分子的单靶点CAR 结构示意图
图16-13 病毒感染后3 天，检测T 细胞中GFP 表达情况