构建单靶点CAR-T细胞并鉴定其功能

本部分工作主要进行单靶点CAR-T细胞构建及其增生和杀伤等分析，探讨单靶点CAR-T细胞杀伤食管鳞癌细胞的能力。主要工作包括：①CAR序列表达质粒的构建，根据文献报道，合成CD276或HER2特异性的2代CAR全序列，并分别克隆入慢病毒表达载体，构建单靶点CAR表达质粒；②生产慢病毒，利用磷酸钙将质粒转染293T细胞，收集病毒上清，测定病毒滴度后待用；③制备CAR-T细胞，将纯化的CD8+ T细胞加入CD3/CD28磁珠活化48小时后，加入病毒感染；感染72小时后，测定CAR表达情况；④CAR-T细胞增生和杀伤功能鉴定，观察单靶点CAR-T细胞增生与分化情况；利用共孵育实验和无标记动态细胞分析技术（real time cellular analysis， RTCA）等观察单靶点CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的潜能与活性。(https://www.daowen.com)