4.2.2　原生质体纯化

4.2.2　原生质体纯化

经酶解处理后，得到的混合液中除了完整的、未损伤原生质体外，还含有亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未消化细胞、破碎或损伤原生质体等，清除这些杂质的过程称为原生质体纯化。原生质体纯化主要通过离心沉淀法、漂浮法、不连续梯度法等方法实现。

1）离心沉淀法

利用比重原理，原生质体纯化的沉降法是在比重小、具有一定渗透压的溶液中，先对酶液处理好的混合物进行过滤，然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉降于试管底部。此法对离心力无严格要求，操作比较简单，但在游离和清洗过程中易损伤原生质体。

2）漂浮法

漂浮法是采用比原生质体密度大的高渗溶液，使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。由于存在高渗溶液对原生质体的破坏作用，因此仅能获得少量完好的原生质体。(https://www.daowen.com)

3）不连续梯度法

原生质体纯化的不连续梯度法是采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。这种梯度的制备方法：在离心管中先加入溶于培养基中的500 mmol／L蔗糖，再加入溶于培养基中的140mmol／L蔗糖和360 mmol／L山梨醇，最后一层是悬浮在酶液中的原生质，其中含有300 mmol／L山梨醇和100 mmol／L CaCl2。经400 g 5 min离心后，在蔗糖层上出现一个纯净的原生质体层，而碎屑则位于管底。该方法可防止因挤压引起的原生质体破碎，原生质体收获量较大，且纯化效果较好。

以叶肉细胞为例，如图4.2所示，图解说明了原生质体分离及纯化的技术流程。分离出来的原生质体一般呈球形。

图4.2　叶肉原生质体分离和纯化的技术流程