4.2.3　原生质体活力测定

4.2.3　原生质体活力测定

新分离得到的原生质体要经过活性检测并调整好起始密度后才能进行培养。原生质体活力直接反映了原生质体分离和纯化技术的成败，主要方法有形态识别法、相差显微镜观察法和染色法。

1）形态识别法

形态上完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形原生质体为有活力原生质体。如果进一步将其转入低渗培养液或洗涤液中，可见到分离操作中被高渗溶液缩小了的原生质体会恢复原状，这种正常膨大的原生质体即为有活力的原生质体。

2）相差显微镜观察法

在相差显微镜下观察细胞质环流和正常细胞核的存在与否来鉴别细胞的活性。

3）染色法(https://www.daowen.com)

（1）酚藏花红染色法

用0.1%的酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。

（2）伊凡蓝染色法

利用0.025%伊凡蓝染色原生质体时，有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，完整的活细胞则不能摄取它，因此不着色的细胞为活细胞。

（3）荧光素二乙酸酯染色法

荧光素二乙酸酯（FDA）染色法又称可以对活细胞进行快速测定。FDA既不发荧光也不具极性，能自由地穿越细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分（荧光素）释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。死细胞不具有此过程。当紫外光照射时，荧光素产生绿色荧光，据此鉴别细胞的活性。测定方法：先用丙酮制备0.5%的FDA贮备液，置于0℃下保存；测定细胞活力时，将贮备液加到原生质体悬浮液中，FDA液须加入适当的渗透压稳定剂，贮备液量以终浓度为0.01%为准；保温5 min，用带有适当激发片和吸收片的水银灯对细胞进行检查，发荧光的原生质体为活细胞。