9.1.3 分离细胞
动物体内（或胚胎组织）各种组织均由多种细胞和纤维成分组成，一般体积大于1mm3的组织块置于培养瓶后，处于周边的少量细胞可能生存和生长，而大部分内部细胞因营养物质穿透有限而代谢不良，且受纤维成分束缚而难以生长。为获取大量生长良好的细胞，必须把组织块分散开，形成细胞悬液。对于不同的实验目的和材料，分散的方法和条件各有不同。常用的方法主要有机械分散法和消化分离法两类，有时两者也可联合使用。
1）机械分散法
若所取材料纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针头），使细胞通过针头压出，或在尼龙筛（不锈钢网筛）内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，可避免细胞受化学物质影响，但易对组织造成机械损伤，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织，如图9.1所示。
图9.1 机械分散法操作示意图
2）消化分离法
消化分离法是用酶或螯合剂把已经剪切成较小体积的组织块进一步分散，使之成为小细胞团或单个细胞状态的方法。消化作用主要是除掉细胞间质，使细胞相互散开，但不损害细胞本身。该法制得的细胞悬液经接种培养后容易贴壁生长。不同组织可选用不同的消化手段。
（1）胰蛋白酶消化法
胰蛋白酶是从动物胰脏中分离提取的一种水解酶，可使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶的消化效果取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。该酶常用的浓度一般在0.1%～0.5%，pH为8～9。一般温度低、组织块大、酶浓度低时消化时间长；反之，应减少消化时间。酶浓度过大和消化时间过长，会导致细胞被消化掉，当然消化不足也达不到分散细胞的目的。
胰蛋白酶消化法有热处理（37℃）和冷处理（4℃）两种不同的处理方法，如图9.2所示。热处理法所需时间较短，较常用；而冷处理法对细胞的损伤较小，有利于获得较多的活细胞和较多的细胞类型。
图9.2 胰蛋白酶消化法操作示意图
热处理法的流程如下：
①将组织用刀切成2～3 mm3大小的小块，或用剪刀剪碎。用不含钙镁离子的Hanks液洗涤组织小块。(https://www.daowen.com)
②将组织小块转移到试管或离心管中，加入符合要求的BSS溶液，静置10 min，间或摇动或搅拌。
③吸去BSS，加入酶液。密封管口后，在37℃条件下消化1～4 h，中间摇动数次。在组织块量较大时，可将材料转移到胰蛋白酶消化瓶或三角瓶内，加入胰蛋白酶消化液，放在磁力搅拌器上，37℃下搅拌消化。
④消化一定时间后，待组织小块下沉后，过滤或离心分离收集细胞悬液。下沉小块内再加入新鲜的胰蛋白酶液，重复进行步骤③的消化过程，并再次收集细胞悬液，与前面收集的已冷却的悬液合并。可以反复重复消化和收集过程，直至消化完为止。
⑤将得到的细胞悬液离心去除胰蛋白酶消化液。
⑥将细胞重新悬于培养液中，用血球计数板计数。用培养液将细胞悬液稀释，一般细数为106 mL，然后接种到培养瓶内培养。
（2）胶原酶消化法
胶原酶是一种由细菌中提取出的酶，对胶原成分有强烈的消化作用，适用于消化较硬、含较多结缔组织或胶原成分的组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶在Ca2+和Mg2+存在下仍有活性，血清也不易使其失活，因此可用含有Ca2+和Mg2+的BSS配制或溶于含血清的培养液中。
将剪碎并用BSS洗涤过的组织小块放入培养液内，加入胶原酶溶液，使胶原酶的最终浓度为200 U／mL或0.1～0.3mg／mL，37℃温育消化。温育时间则与所需解离的组织有关，一般需4～48 h，在解离某些肿瘤组织时，可能需要温育5天或更长时间。
（3）其他消化酶消化法
除上述两种常见的消化酶外，还有其他一些消化酶，如链霉蛋白酶。据报道该酶适应范围较广，分散效果也好。但该酶不受血清影响，故消化后应充分漂洗，此酶也不适于做传代时的消化处理。粘蛋白酶、蜗牛酶、透明质酸酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶等也是可以用于制备培养细胞的消化酶。在使用时，应根据欲分离组织的具体成分而定，需要时可将几种酶联合使用，如胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏细胞。
（4）螯合剂消化法
可用来消化组织的螯合剂有柠檬酸钠、EDTA-Na2等。它们是非酶消化物，常用不含Ca2+和Mg2+的BSS配成0.02%的工作液，对一些组织尤其是上皮组织分散效果较好。EDTA的主要作用是通过螯合细胞间质中的Ca2+和Mg2+，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。
EDTA的作用比胰蛋白酶缓和，单独消化新鲜组织时少用。EDTA最适用于消化传代细胞，消化5～10 min后，用BSS洗2～3次，加入培养液，用吸管从瓶壁上把细胞吹打下来，制成悬液进行培养。EDTA和胰蛋白酶以不同比例联合使用效果较好，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，还可降低胰酶的用量和毒性作用。EDTA不受血清抑制，因此消化后需彻底漂洗，否则会影响细胞生长。
